张绪慧 陈达理 董小锋 :中药复方“消癌根”对肿瘤生长的影响

中药复方“消癌根”是广东省化州市人大代表、丽岗镇尖岗岭董草原中医诊所所长董草原医生历经30余年研究探索、临床应用总结出来的纯中药方剂。大量临床实践证明该方剂治疗肿瘤有效。为了科学求证本方剂的作用机理，董草原医生先后委托南方医科大学和广州中医药大学生化教研室行了相关实验研究。 材料与方法 一、实验动物昆明种小鼠60只，4～6周龄，体重18～22g，雄性，购于南方医科大学动物中心。分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。r 二、细胞株细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株A180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。 三、主要药物、试剂和仪器纯中药复方消癌根，由董草原医生提供。 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。 PCNA一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；VEGF一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；生物素 化兔抗山羊二抗试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品。试剂盒中内容：DAB显色剂试剂盒武汉博士德生物工程有限公司产品试剂盒中内容： 四、主要溶液的配制： 0．01MPBS缓冲液(pH7．2~7．4)：1000m1 2~蒸水中，加氯化钠9g，NaH2P04。12H20 6g，NaH2P04·2H20 0．4g，调整pH值至7．2~7.4。 ’ 0．1M枸橼酸冲液(pH6．0)：1000ml双蒸水中加枸橼酸三钠(C6HsNa307·2H20)3g，枸橼酸(C6H807·H20)0．4g。调pH至6．0。 3％H202甲醇或0．01MPBS，97ml加入3ml市售的30％H202既得3％H202。 五、消癌根药液的制备(同第一部分) 六、荷瘤小鼠模型的建立(同第一部分) 七、实验分组和给药(同第一部分) 连续用药15天后停药，处死小鼠后剥离瘤块，10％甲醛固定。 八、取材的处理(固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片) 组织块在甲醛里固定6个小时后取出用流水冲洗，滤纸吸去多余水分．。注意遵守以下原则：(1)取材时避开瘤体中央液化坏死区，避免在瘤体外周取材，取材部位应介于两者之间。(2)从剥离瘤体、切取组织块到抽入固定液，要尽量迅速，以尽量保持材料的新鲜，一般在1分钟内把组织块浸入固定液。(3)所用的固定液及容器必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。(4)切割组织的刀必须锋利干净，操作时必须避免拉、锯、压等动作以免造成细胞损伤。 1．脱水： 。70％乙醇 4℃1h 80％乙醇 4℃ 1h 90％乙醇 4℃1h 95％乙醇 4℃过夜 100％乙醇I 4℃30min 100％乙醇Ⅱ 4℃ 30min 100％乙醇Ⅲ 4℃30min 二甲苯I 4℃30min 二甲苯Ⅱ 4℃ 30min 二甲苯Ⅲ 4℃ 30min 石蜡I 4℃ 30min 石蜡Ⅱ 4℃ 30min 石蜡Ⅲ 4℃ 30min 石蜡Ⅳ 4℃ 30min 包蜡 <60℃ 2．切片前载玻片涂黏附剂：将待涂载玻片放在玻片架上浸入APES与丙酮混合液(比例：1：50)中，常温下晾干备用。 3．切片：厚度一般在4~6μm. 烤片：切片附黏后置60cc烤箱中2个小时。保存：备用切片置4℃冰箱中保存。 九、免疫组化染色 1．石蜡切片常规脱蜡至水 二甲苯I 5min二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅲ 5min无水乙醇I lmin 无水乙醇Ⅱ lmin 95％酒精 30s 90％酒精 30s 80％酒精 30s 2．30％H202加蒸馏水10份混合，室温放置10min~lh以灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗，2minX3次。 3．热修复抗原：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃"-08℃之间并持续10~15分钟。取出容器，室温冷却10~20min，蒸馏水冲洗2次，PBS洗，2minX3次。 4．抗原修复液l：滴加在切片上室温5～10min后，PBS洗，2minx3次。 5．滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，甩去多余液体，不洗。 6．滴加PCNA／VEGF一抗，37℃孵育1h左右，或4℃过夜，PBS洗3minX5次。 7．滴加生物素化二抗，37~C20min，PBS洗，3minX5次。 8．滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗，4minx5次。 9．DAB显色：取lml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，控制反应时间，一般5~30min(显色的具体情况而定)，蒸馏水洗涤，3minx5次。 10．苏木素轻度复染，约60s。 ． 11．中性树胶封片。设阴性对照切片，用PBS代替特异性第一抗体。 十、HE染色 染色方法： 二甲苯I 5min二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅲ 5min无水乙醇I　 lmin无水乙醇Ⅱ　lmin95％酒精， 30s90％酒精 30s80％酒精 30s苏木清　　　lOmin (蒸馏水洗数秒)1％盐酸酒精分化20s 流水冲洗（返蓝） ５min伊红 1min30s80%酒精 5s90%酒精 5s95%酒精 5min无水乙醇I 5min无水乙醇II 5min无水乙醇III 5min二甲苯石炭酸 5min二甲苯I 5min二申苯I 5min 十一、结果判断 1．肿瘤内微血管计数(microvessel density count，MDC)：于每只荷瘤小鼠瘤体内的5个不同部位取材，每块5mmx5mmx2mm，排除肿瘤出血区及边缘反应区。应用HE染色，低倍镜(x40)观察确定每例切片中3个血管计数最高区域，然后在高倍镜(×100)下记数热点区域 (hot spots)内每高掊镜视野的MDC，为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔>8个细胞面积的血管不予计数。其平均值即为该例肿瘤的MDC值。 2．PCNA的阳性判断标准，细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，每个标本随机观察10个高倍镜视野(×100)，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性细胞数。VEGF以细胞浆内出现棕黄色为阳性，算阳性区域面积占瘤细胞总面积的百分率表示。 结果 一、消癌根对肿瘤组织微血管计数(MDC)的影响 如表1所示：与阴性组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组的MDC均明显降低(P<0．05)。而环磷酰胺组的MDC与阴性对照组比较无显著性差异(p>0.5)。消癌根高剂量的MDC明显低于消癌根低剂量组的MCD明显低于消癌根低剂量组的MCD(p<0.05)。 表1消癌根对肿瘤组织微血管密度（MCD）的影响（X±s） 组别 始 n 剂量 MDC （g/kg） (条) 阴性对照组 11 11 - 15.7±1.4 成部分环磷酰胺组 11 11 20 14.8±1.7 消癌根高剂量组 11 11 24 5.6±1.7*▲ 消癌根低剂量组 11 11 12 8.2±4.6* 注：与阴性对照组比较：★P<0．05，与消癌根低剂量组比较：▲P<0．05。 二、消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响 对于VEGF的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组均显著弱于阴性对照组(P<0．05)。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组VEGF的表达明显减弱，与环磷酰胺 组相比较有显著性差异(p<0．05)。消癌根高剂量组与消癌根低剂量组比较，其VEGF的表达亦明显减弱(P<0．05)(如表2所示)。 表2消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响(Х±s) 组别 始 n 剂量 VEGF （g/kg） (条) 阴性对照组 11 11 — 13.50±1.60 环磷酰胺组 11 11 20 9.08±3.50 消癌根高刺量组 I1 11 24 4.49±2.18 消癌根低剂量组 ll 11 12 7.51±1.16 注：与阴性对照组比较：★P<0．05，与消癌根低剂量组比 较：▲P<0．05，与环磷酰胺组比较：△P<0．05。 三、消癌根对肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)的 影响 如表3所示，对于PCNA的表达，消癌根高剂量组和 消癌根低剂量组与阴性对照组比较均显著减弱(P< 0．01)。与环磷酰胺组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低 剂量组PCNA的表达均明显减弱(尸<0．01)。消癌根高剂量 组的PCNA的表达明显弱于消癌根低剂量组(P<0．01)。 表3消癌根对肿瘤组织细胞增殖核抗原(PCNA)的影响(又±s) 组别 始 n 剂量 PCNA （g/kg） (条) 阴性对照组 11 11 — 5.73±2.58 环磷酰胺组 11 11 20 34.01±2.52* 消癌根高刺量组 I1 11 24 12.10±1.86*▲△ 消癌根低剂量组 ll 11 12 22.84±2.26* 注：与阴性对照组比较：★P<0．05，与消癌根低剂量组比较：△p<0．05，与环磷酰胺组比较：▲P<0．05。 讨论 由于肿瘤血管生成在肿瘤生成及肿瘤侵袭转移中的重要作用，以及VEGF对肿瘤血管形成的促进作用已在多种肿瘤中得以证实，VEGF可作为抗癌治疗的新靶点，针对VEGF及其受体的抗血管治疗，为肿瘤防治开辟另一新途径。 本实验以S180荷瘤小鼠为研究对象，分别以环膦酰胺和蒸馏水为阳性对照和阴性对照，来研究消癌根的抑瘤情况及其可能的机理。结果表明消癌根高剂量组抑瘤率达到35．2％，低剂量组亦达到22．1％。说明该药具有一定的抗肿瘤效果。其机理可能是通过抑制VEGF、PCNA的表达来实现的。

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