基于抗菌效价检测的板蓝根药材品质评价方法的研究
中药质量生物控制已成为中药质量控制研究发展的趋势…，《中国人民共和国药典》(2010年版)的编写大纲的主要任务中已明确提出：“中药的质量标准要逐步由单一指标成分定性定量测定，向活性有效分及生物测定的综合检测过渡。”
为了探索建立基于生物效价检测的中药品质评价新方法，本文选择临床应用广泛、疗效确切．但药效物质不明确，现无行之有效的方法进行质量控制的板蓝根作为模式药物，首先尝试从抗菌生物活性方面进行研究，为完善现行的板蓝根质量控制标准提供技术支持。同时本文采用建立的方法对 GAP种植基地的不同批次及不同地理分布的板蓝根药材样品进行生物效价检测，旨在验证所建立方法是否可用来评价不同产地来源板蓝根的品质优劣，也为从来源上保证板蓝根药材的品质稳定提供参考。
一、材料与仪器
303-3型水夹套恒温培养箱，上海树立仪器仪表有限公司；WGZ-2型(细菌)浊度仪，上海昕瑞仪器仪表有限公司；牛津杯(内径6．
抗生素检定培养基Ⅱ号(批号060306：0H7．9_40．1)购于北京三药科技开发公司；庆大霉素(批号130326-200314；638 U／mg)中国药品生物制品检定所提供；板蓝根药材：1—5号(批号：06001-06005)产自安徽省阜阳市GAP基地，6—10号分别产自河北省安国市、内蒙古自治区赤峰市、甘肃省武都市、黑龙江省佳木斯市，安徽省亳州市，经解放军302医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定为十字花科植物菘蓝(Isaris indigotica Fort．)的干燥根。金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]标准菌株由中国药品生物制品检定所提供。
二、方法
1．板蓝根供试品溶液的制备
精密称取样品约
2．硫酸庆大霉素标准品溶液的制备
精密称取庆大霉素粉末(638 U／mg)约209 mg，用灭菌磷酸缓冲盐溶液(pH 7．8)溶解并定容至100 mL，得2．09 mg／mL(1320 U／mL)硫酸庆大霉素液溶，取上述溶液100μl(约132 U／mL)，用磷酸缓冲液溶解并定容至50 mL，得2．64 U／mL的庆大霉素母液，冷冻保存备用。l临用时用灭菌磷酸缓冲盐溶液稀释至所需浓度。
3．不同因素对抑菌圈直径影响的方法
照《中国药典》2005年版二部附录ⅪA抗生素微
生物检定法管碟法进行。采用单因素方法对菌浓度、培养时间、细菌传代数进行考察，操作步骤如下：
取双碟，分别注入加热融化的培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平面上使凝固，作为底层。用灭菌水将金黄色葡萄球菌斜面培养物的菌苔洗下，用浊度仪测定稀释调整至所需浊度．作为菌悬液。另取培养基适量加热融化后，放冷至56~C．加入占1％培养基体积的菌悬液，迅速摇匀，在每1双碟中分别加入5mL，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均。匀安置牛津杯6个(方法学考察)或4个(效价测_定)，在牛津杯中分别滴加供试品溶液(方法学考察采用2号样品(浓度lg／mL)制备的供试品溶液)和标准品溶液，，用陶瓦圆盖覆盖。
(1)茵浓度的考察。
参照管碟法操作步骤，对4代金黄色葡萄球菌斜面培养物0．17 MCF、0．38 MCF、0．57 MCF、0．79 MCF、1．60 MCF浊度的菌悬液分别平行三个碟进行试验，培养时间为15．5 h，结果见图1。
(2)培养时间的考察。
参照管碟法操作步骤，制备1．10MCF浊度的4代金黄色葡萄球菌斜面培养物的菌悬液，对14．0 h、14．5 h、15．0 h、15．5 h、16．0 h五个培养时间分别平／行三个碟进行试验，结果见图2。
(3)细菌传代数的考察。
参照管碟法操作步骤，制备1．10 MCF浊度的1代、2代、3代、4代、5代金黄色葡萄球菌斜面培养物的菌悬液，对每一传代数平行三个碟进行试验，培相时间为15．5 h，结果见图3。
4．价的测定
采用2．3筛选的适宜试验条件，按管碟法操作步骤，以庆大霉素为标准品，按《中国药典二部》(2001年版)附录生物检定项下(2·2)法，对10个板蓝根供试品进行抗菌效价测定，供试品浓度(0．
三、结果
1．菌浓度的考察结果
由图1可知：与其余菌浓度的抑菌圈直径相比较，0．38 MCF菌浓度的抑菌圈直径最大，因此0．38MCF为适宜的菌浓度。
2．培养时间的考察结果
由图2可知：与其余培养时间的抑菌圈直径相比较，15．0 h培养时间的抑菌圈直径最大．所以15．0 h为适宜的培养时间。
3．细菌传代数的考察结果
由图3可知：由于1代、2代细菌处于复苏初期：5代细菌处于活力衰退期，且抑菌圈不清晰，且1代、2代、5代细菌活力均不稳定，3代、4代细菌处于活力旺盛期，且这两代细菌的抑菌圈直径相差不大．能保证试验结果的稳定性和重现性，3代、4代细菌为适宜细菌传代数。
综上所述：板蓝根的抗菌效价测定适宜条件为：菌浓度：0．38 MCF，培养时间：15 h，细菌传代数：3代或4代金黄色葡萄球菌。
4．不同批次、不同产地来源板蓝根药材抗菌效价的测定结果
由图4可知：1—5号为GAP基地不同批次的药材，其抗菌效价差别不大，在3．80 U左右；6一10号样品为其他产地药材，抗菌效价差别明显．从1．320．83 U到6．77 U不等。
四、结语
本文将生物效价检测方法用于板蓝根质量控制和品质评价是一个新的尝试，首次建立了板蓝根的抗菌效价测定方法。研究发现，细菌传代数、菌浓度、培养时间等因素对管碟法测定板蓝根抗菌效价影响较大。通过较系统的考察和筛选．得出检测板蓝根抗金黄色葡萄球菌生物效价的最佳条件为：以药典规定的管碟法条件为基础，细菌传代数为3代或4代，菌浓度为0．38 MCF浊度，培养时间为15 h。
研究表明，不同来源的板蓝根药材品质差异明显：来源于同一GAP种植基地不同批次的药材抗菌效价差别不大，约为3．80 U左右，提示实行GAP规范化种植、管理，有利于保证不同批次药材品质的稳定；而来源于不同产地的药材抗菌效价差别较大．从0．83 U到6．77 U不等，且随纬度增加呈下降趋势．提示日照时间长短对药材的抗菌品质有影响。综合不同来源的板蓝根药材抗菌效价测定结果．提示应选择适宜产地。对板蓝根药材实行GAP规范化种植、管理。以保证其品质均一、稳定。
本文建立的抗菌效价生物测定方法．较现行药典板蓝根仅以精氨酸为定性检查的质控方法具有现实意义和优势，客观灵敏、简便易行、利于推广，特别是直接关乎其有效性，可为临床合理用药提供参考。
抗菌活性为板蓝根的生物活性之一，笔者所在的课题组还在从抗病毒、抗炎、其它抗菌活性等多方面进行探索．以期从中选择一到多个行之有效的生物效价测定方法。相关文章将陆续报道。
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