柑桔皮总黄酮的提取及鉴别
核心提示：黄锁义 ，罗 燕 ，张婧萱 ，王三艳 ，陆辉宇
(1．右江民族医学院化学教研室，广西百色 533000；
2．右江民族医学院临床医学本科班，广西百色 533000；
3．右江民族医学院检验医学本科班，广西百色 533000)
柑桔皮为芸香科植物橘
(1．右江民族医学院化学教研室，广西百色 533000；
2．右江民族医学院临床医学本科班，广西百色 533000；
3．右江民族医学院检验医学本科班，广西百色 533000)
柑桔皮为芸香科植物橘
黄锁义 ，罗 燕 ，张婧萱 ，王三艳 ，陆辉宇
(1．右江民族医学院化学教研室，广西百色 533000；
2．右江民族医学院临床医学本科班，广西百色 533000；
3．右江民族医学院检验医学本科班，广西百色 533000)
柑桔皮为芸香科植物橘树成熟果实的果皮，在我国有悠久的药用历史。柑桔树是我国亚热带地区栽培最广的果树，它四季长青，树枝优美。柑桔果实全都是宝，其皮、肉都是正统的中药。我国古代医学认为：柑桔皮性味辛、微温、无毒、人脾、肺经，有理气调中、燥湿消痰、行气导滞的功效，具有消炎，抗溃疡，抑菌及利胆等作用。临床上用于治疗和预防感冒、治疗胆结石、风湿性关节炎、还可用于防治高血压和动脉硬化。预防血栓的形成，降低胆固醇，减少心梗的发生，也可用于呕吐、腹泻、心腹气痛的治疗，以及抑制多种消化道肿瘤的生长、抗自由基等。
现代医学证明：柑桔皮中主要含有黄酮类化合物、类胡萝卜素类、硫胺素、核黄素、膳食纤维等食用和药用成分，特别是黄酮类化合物在柑桔皮中的含量尤为丰富，黄酮类化合物具有多种生理功能。研究证明柑桔皮具有很高的药用价值，为了充分利用，避免资源的浪费，我们对柑桔皮中总黄酮进行提取及鉴别，本文方法未见文献报道，现将其过程介绍如下。
1材料与方法
1．1 材料①市售新鲜的柑桔取其皮。②试剂：95％乙醇AR；甲醇AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；正丁醇AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；镁粉AR；乙酸镁AR；氢氧化钠AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；芦丁标准品(中国生物制品检定所)。③仪器设备：UV-755B紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)；DZF．150小型真空恒温干燥箱(郑州长城科工贸易有限公司)；80-2离心沉淀器(上海分析器械厂)；ZF-I型三用紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
1．2 方法
1．2。1 工艺流程柑桔皮中总黄酮提取工艺流程见图l。
1．2．2 操作步骤取市售新鲜柑桔，取皮，洗净，切碎，烘干，取135 g，置于铝锅中，加蒸馏水煮沸3 h。冷却后进行粗滤，对滤渣用上述方法进行再浸取2次，将3次滤液合并，滤液用高速离心机分离15 min，l 500 r／min。并进行加热浓缩(加热温度在85％左右)。浓缩冷却后加入等体积95％乙醇，放入冰箱内2h。用高速离心机进行分离工5 min，1 500 r／min。过滤得滤液滤渣，弃去滤渣。对滤液进行蒸发浓缩(加热温度在85~C左右)。待乙醇蒸发完后，将浓液置于真空干燥箱中干燥成疏松固体，粉碎得终产物。
1．3 定量实验一总黄酮的含量测定
l．3．1 实验原理 采用硝酸铝比色法。黄酮类物质是以2一苯基并吡喃酮为母核的多羟基化合物，可与糖苷类物质遇碱变成明显黄色，其机制是黄酮类物质在碱性条件下其苯吡喃酮的1，2碳之间的C—O键打开成查耳酮的检测方法常用分光光度计法或液相色谱法。分光光度法以用黄酮与铝离子在碱性与亚硝酸存在条件下形成黄酮的铝络合物，生成稳定的黄色。黄色的深浅与黄酮含量呈一定的比例关系，可以芦丁(标准样)作对照，于500nm波长处比色定量测定。
l．3．2 标准曲线的制备①标准溶液的制备：精密称取芦丁对照品200 mg，置于100 ml容量瓶中，加入95％乙醇溶液并稀释至刻度，摇匀。精密称取lO m1置于100 mⅡ容量瓶中，加入95％乙醇使成100 mI，摇匀即得(每毫升含有无水芦丁0．2 mg)②标准曲线的制备：精密吸取对照溶液0。O，2．0，4．O，6．O，8．O，l2．0 m1分置于50 m1容量瓶中，各加95％乙醇12 ml，加5％亚硝酸钠溶液2．O ml，混匀，放置6 min，再加10％硝酸铝溶液2．0 mI，放置6min，加5％氢氧化钠溶液20 m1，最后用95％乙醇稀释至刻度，摇匀，以第一瓶为空白溶液，用UV-755B紫外可见分光光度计，在500 nm上测定吸光度。结果见表1。
根据上表得一回归方程：A=1．243 3C-O．008 l，r=0．999 1，n=5，其中截距一()．008 1，斜率为l。243 3。
l．3．3 提取物含量的测定精密称定提取物l。500 o g，置索氏提取器中，加95％乙醇回流至无色(6—8 h)，将提取液置于烧杯中，水浴加热浓缩至干，再用热水洗涤3次，将洗液移至分液漏斗中，并加无水正丁醇液萃取3到5次，每次10 ml，合并萃取液于烧杯中，水浴蒸干，再加95％乙醇使溶解，并移于50 ml容量瓶中，再加95％乙醇至刻度，摇匀。精密取10 ml于50 ml容量瓶中加95％乙醇至刻度，摇匀，按标准曲线的制备操作测定吸光度，A=O．328。
1．3。4 颜色反应
紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈淡黄色，在紫外光下呈淡蓝色并有荧光斑点。
浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏0．5 min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。 三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。
乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1％乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。
盐酸一镁粉反应：取乙醇提取液1 m1于试管中加镁粉，再加入浓的盐酸数滴(1次加入)，在泡沫处呈紫红色。
1．3．5 纸层析取样品溶液10 μl点在滤纸上。用正丁醇：醋酸：水=4：1：5为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1％氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。
2 结果
A=0．328，根据回归方程：A=]．243 3C—O．008 1，计算样品中总黄酮的含量C：4．49％。回收实验：精密称提取物1．500 0g，加入芦丁对照品]．000 o g，同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为98．o％。
3 讨论
实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为98．0％，利用本文所提供的提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。此方法采用全物理过程，无任何污染，且该方法操作简单方便，是一条理想的从柑桔皮中提取黄酮类物质的有效途径。
黄酮类化合物是一类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能。
黄酮类化合物具有抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松，它能清除自由基、超氧化物和羟基自由基、抑制脂质过氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化抗衰老、抗辐射等作用。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引入瞩目。柑桔分布广泛，本文实验结果表明，柑桔皮中含有较为丰富的黄酮。因此，柑桔皮具有广泛开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。
《时珍国医国药》
(1．右江民族医学院化学教研室，广西百色 533000；
2．右江民族医学院临床医学本科班，广西百色 533000；
3．右江民族医学院检验医学本科班，广西百色 533000)
柑桔皮为芸香科植物橘树成熟果实的果皮，在我国有悠久的药用历史。柑桔树是我国亚热带地区栽培最广的果树，它四季长青，树枝优美。柑桔果实全都是宝，其皮、肉都是正统的中药。我国古代医学认为：柑桔皮性味辛、微温、无毒、人脾、肺经，有理气调中、燥湿消痰、行气导滞的功效，具有消炎，抗溃疡，抑菌及利胆等作用。临床上用于治疗和预防感冒、治疗胆结石、风湿性关节炎、还可用于防治高血压和动脉硬化。预防血栓的形成，降低胆固醇，减少心梗的发生，也可用于呕吐、腹泻、心腹气痛的治疗，以及抑制多种消化道肿瘤的生长、抗自由基等。
现代医学证明：柑桔皮中主要含有黄酮类化合物、类胡萝卜素类、硫胺素、核黄素、膳食纤维等食用和药用成分，特别是黄酮类化合物在柑桔皮中的含量尤为丰富，黄酮类化合物具有多种生理功能。研究证明柑桔皮具有很高的药用价值，为了充分利用，避免资源的浪费，我们对柑桔皮中总黄酮进行提取及鉴别，本文方法未见文献报道，现将其过程介绍如下。
1材料与方法
1．1 材料①市售新鲜的柑桔取其皮。②试剂：95％乙醇AR；甲醇AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；正丁醇AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；镁粉AR；乙酸镁AR；氢氧化钠AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；芦丁标准品(中国生物制品检定所)。③仪器设备：UV-755B紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)；DZF．150小型真空恒温干燥箱(郑州长城科工贸易有限公司)；80-2离心沉淀器(上海分析器械厂)；ZF-I型三用紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
1．2 方法
1．2。1 工艺流程柑桔皮中总黄酮提取工艺流程见图l。
1．2．2 操作步骤取市售新鲜柑桔，取皮，洗净，切碎，烘干，取135 g，置于铝锅中，加蒸馏水煮沸3 h。冷却后进行粗滤，对滤渣用上述方法进行再浸取2次，将3次滤液合并，滤液用高速离心机分离15 min，l 500 r／min。并进行加热浓缩(加热温度在85％左右)。浓缩冷却后加入等体积95％乙醇，放入冰箱内2h。用高速离心机进行分离工5 min，1 500 r／min。过滤得滤液滤渣，弃去滤渣。对滤液进行蒸发浓缩(加热温度在85~C左右)。待乙醇蒸发完后，将浓液置于真空干燥箱中干燥成疏松固体，粉碎得终产物。
1．3 定量实验一总黄酮的含量测定
l．3．1 实验原理 采用硝酸铝比色法。黄酮类物质是以2一苯基并吡喃酮为母核的多羟基化合物，可与糖苷类物质遇碱变成明显黄色，其机制是黄酮类物质在碱性条件下其苯吡喃酮的1，2碳之间的C—O键打开成查耳酮的检测方法常用分光光度计法或液相色谱法。分光光度法以用黄酮与铝离子在碱性与亚硝酸存在条件下形成黄酮的铝络合物，生成稳定的黄色。黄色的深浅与黄酮含量呈一定的比例关系，可以芦丁(标准样)作对照，于500nm波长处比色定量测定。
l．3．2 标准曲线的制备①标准溶液的制备：精密称取芦丁对照品200 mg，置于100 ml容量瓶中，加入95％乙醇溶液并稀释至刻度，摇匀。精密称取lO m1置于100 mⅡ容量瓶中，加入95％乙醇使成100 mI，摇匀即得(每毫升含有无水芦丁0．2 mg)②标准曲线的制备：精密吸取对照溶液0。O，2．0，4．O，6．O，8．O，l2．0 m1分置于50 m1容量瓶中，各加95％乙醇12 ml，加5％亚硝酸钠溶液2．O ml，混匀，放置6 min，再加10％硝酸铝溶液2．0 mI，放置6min，加5％氢氧化钠溶液20 m1，最后用95％乙醇稀释至刻度，摇匀，以第一瓶为空白溶液，用UV-755B紫外可见分光光度计，在500 nm上测定吸光度。结果见表1。
根据上表得一回归方程：A=1．243 3C-O．008 l，r=0．999 1，n=5，其中截距一()．008 1，斜率为l。243 3。
l．3．3 提取物含量的测定精密称定提取物l。500 o g，置索氏提取器中，加95％乙醇回流至无色(6—8 h)，将提取液置于烧杯中，水浴加热浓缩至干，再用热水洗涤3次，将洗液移至分液漏斗中，并加无水正丁醇液萃取3到5次，每次10 ml，合并萃取液于烧杯中，水浴蒸干，再加95％乙醇使溶解，并移于50 ml容量瓶中，再加95％乙醇至刻度，摇匀。精密取10 ml于50 ml容量瓶中加95％乙醇至刻度，摇匀，按标准曲线的制备操作测定吸光度，A=O．328。
1．3。4 颜色反应
紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈淡黄色，在紫外光下呈淡蓝色并有荧光斑点。
浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏0．5 min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。 三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。
乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1％乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。
盐酸一镁粉反应：取乙醇提取液1 m1于试管中加镁粉，再加入浓的盐酸数滴(1次加入)，在泡沫处呈紫红色。
1．3．5 纸层析取样品溶液10 μl点在滤纸上。用正丁醇：醋酸：水=4：1：5为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1％氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。
2 结果
A=0．328，根据回归方程：A=]．243 3C—O．008 1，计算样品中总黄酮的含量C：4．49％。回收实验：精密称提取物1．500 0g，加入芦丁对照品]．000 o g，同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为98．o％。
3 讨论
实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为98．0％，利用本文所提供的提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。此方法采用全物理过程，无任何污染，且该方法操作简单方便，是一条理想的从柑桔皮中提取黄酮类物质的有效途径。
黄酮类化合物是一类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能。
黄酮类化合物具有抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松，它能清除自由基、超氧化物和羟基自由基、抑制脂质过氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化抗衰老、抗辐射等作用。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引入瞩目。柑桔分布广泛，本文实验结果表明，柑桔皮中含有较为丰富的黄酮。因此，柑桔皮具有广泛开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。
《时珍国医国药》
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