芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病大鼠氧自由基代谢及肺组织形态学的影响

    慢性阻塞性肺疾病(cOPD)是一种严重的慢性呼吸系统疾病。目前，临床上尚无有效的治疗方法遏制COPD发生、发展。芪蛭皱肺颗粒主要由黄芪、水蛭、党参、丹参等药物组成，前期研究表明，芪蛭皱肺颗粒可减轻COPD模型大鼠肺部炎症反应、改善其呼吸功能、干预COPD模型大鼠小气道重塑等[1-2]。本研究通过观察COPD模型大鼠肺组织、血清中超氧化物歧化酶(soD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量及肺组织病理结构的变化，探讨芪蛭皱肺颗粒有无调节氧化／抗氧化失衡、N0水平及防治COPD的效应。
1材料与方法
1．1动物
  SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(200~20)g，甘肃中医学院SPF级实验室提供并饲养，动物合格证号：SCXK(甘)2004—0006-0000005。
1．2药物
    芪蛭皱肺颗粒由黄芪、水蛭、党参等药物组成，甘肃中医学院药物制剂室制备；固本咳喘片，浙江台州南峰药业生产，批号070504。
1．3主要试剂与仪器
    脂多糖(LPS)购自Sigma公司，批号L-2880：兰州牌香烟(焦油量12 mg，烟气烟碱量O．8 mg，烟气一氧化碳量13 mg)购自甘肃烟草工业有限责任公司：考马斯亮蓝、SOD、MDA、NO试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号分别为20080814、20080812、20080809、20080809)。有机玻璃熏箱48 L(20 cmX40 cmX60 cm，自制)，电子分析天平FA2004N(上海精密科学仪器有限公司)，组织匀浆器(上海医疗器械公司)；离心机LXJ一80C(上海医疗器械公司)，721分光光度计(上海安泰分析仪器有限公司)，BL一2000图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)。
1．4分组与造模
    SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组及芪蛭大、中、小剂量组，每组10只。COPD大鼠模型采用气管内滴注LPS加烟熏法复制，分别于第l、14日气管内滴注LPS(0．1 mg／100 g)，第2～13日、第15～28日每日上午在48 L的玻璃密闭箱内持续熏兰州牌香烟雾30 min，每日1次，1支／只。本次实验过程中，共死亡动物7只，通过尸检发现主要由造模、灌胃操作不当所致。
1．5给药
    从造模第15日起，实验动物进行灌胃干预治疗，空白组、模型组分别给予芪蛭皱肺颗粒辅料溶液3 mL：阳性对照组每日给予固本咳喘片(相当原药材0．324 g／kg)；芪蛭小、中、大剂量组每日分别给予不同剂量的芪蛭皱肺颗粒(相当于原药材0．54、1．08、2．16 g／kg)。每日上午灌胃1次，连续28 d。实验药物用量均按体表面积比率换算，用生理盐水配制药液，临床等效剂量为实验中剂量。
1．6肺组织和血清中超氧化物歧化酶、丙二醛及一氧化氮水平测定
    动物饲养第43目，股动脉采血，处死，分离血清备用；取肺组织制备匀浆，取上清液备用。SOD、MDA检测方法严格按试剂盒说明书进行化学比色检测，NO检测方法严格按试剂盒说明书采用硝酸还原酶法进行化学比色检测。
1．7肺组织形态观察
    动物饲养第43日，股动脉采血，处死，取右肺下叶置于4％多聚甲醛中固定：石蜡包埋切片，HE染色，显微镜观察分析。
1．8统计学方法
    采用SPSSl3．O统计软件进行分析。计量资料以xs表示，多组间比较采用方差分析。P<O．05表示差异有统计学意义。
2结果
2．1  芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺组织匀浆中超氧化物歧化酶、丙二醛及一氧化氮含量的影响(见表I)

 
2．2肺组织形态学观察
  空白组显示，大鼠支气管及肺泡结构均正常；支气管黏膜上皮细胞排列整齐，支气管黏膜下未见明显炎细胞浸润，支气管腔内偶有少量分泌物；肺泡结构连续，肺泡壁完整，肺泡腔无扩大；且未见明显炎性细胞渗出。模型组显示，大鼠支气管腔内分泌物明显增多，管腔变窄，部分气管腔内有出血；支气管黏膜皱褶增多，不完整或脱落，支气管壁有炎细胞浸润；肺泡中有明显炎性细胞渗出，肺泡扩张，大量肺泡间隔破坏断裂形成肺大泡；支气管平滑肌增厚；肺血管壁内膜增厚，平滑肌增加，血管壁有炎症细胞浸润。阳性对照组显示，支气管腔内分泌物少；支气管黏膜部分不完整或脱落，支气管壁少量炎细胞浸润；肺泡中有少量炎性细胞渗出，少量肺泡扩张融合成肺大泡；支气管平滑肌及肺内血管无明显改变。芪蛭大剂量组显示，支气管腔内分泌物较少；支气管黏膜基本完整，支气管壁较少炎细胞浸润：肺泡中较少炎性细胞渗出，有肺泡扩张融合成肺大泡；支气管平滑肌及肺内血管无明显改变。芪蛭中剂量组显示，支气管腔内分泌物少；支气管黏膜基本完整，支气管壁少量炎细胞浸润；肺泡中亦有少量炎性细胞渗出；少量肺泡扩张融合成肺大泡；肺间质中无渗血：支气管平滑肌及肺内血管无明显改变。芪蛭小剂量组显示，支气管腔内分泌物较多；支气管黏膜部分不完整或脱落，支气管壁炎细胞浸润及肺泡中炎性细胞渗出较严重；部分肺泡扩张融合成肺大泡；肺间质中无渗血；支气管平滑肌及血管壁平滑肌偶有增厚：少量肺血管壁内膜增厚，血管壁炎症细胞浸润。结果见图1。

3 1．讨论  
    氧化／抗氧化失衡是COPD的发生的机制之一。SOD是体内催化超氧阴离子(Oz)为过氧化氢的关键酶，SOD具有较强的抗氧化作用，能够清除氧自由基、过氧化氢等；体内环境的相对稳定、有效防止自由基对机体的损害起重要的作用。MDA是氧化过程中最终产物之一，是脂质过氧化产物，其增加可能与吸烟活化中性粒细胞，产生活性氧自由基增多有关。有研究表明，COPD患者无论是急性发作期或缓解期，其血清MDA浓度都升高，而SOD降低。N0是一种重要的内皮衍生舒张因子，主要来自精氨酸末端胍基的氮原子。NO能激活鸟苷酸环化酶，使血管内环磷酸鸟苷水平升高，血管扩张，而N0释放减少又使其舒张支气管和肺血管平滑肌的因素以及对血管平滑肌增殖的抑制作用减弱，从而导致慢性炎症的产生㈣。本研究显示，COPD模型大鼠血清、肺组织中SOD、NO水平均显著低于正常组，MDA水平均显著高于空白组，提示脂质过氧化损伤、N0代谢紊乱等促进了COPD的发生、发展，与上述文献报道相符。
    COPD属于中医学“咳嗽”、“喘证”、“肺胀”等范畴。痰、瘀、虚是COPD的病机关键，贯穿其发生发展的始终。根据这一病机特点，制定了益气培元、化痰活血为治疗法则的芪蛭皱肺复方，结台现代中药制剂工艺技术加工为颗粒剂。该制剂由黄芪、党参、麦冬、五味子、枳实、丹参、水蛭等药物组成，以黄芪益正托邪，水蛭逐瘀消癥而共为君药；党参培土生金，丹参活血补血为臣；五味子、麦冬补体助用，枳实开泄疏涤共为佐药。诸药合用，标本兼治，虚实共调，共奏益气培元、化痰活血之功效。本研究结果发现，COPD大鼠经芪蛭皱肺颗粒治疗后，与模型组比较，各治疗组肺组织病理损害有不同程度减轻，芪蛭大、中剂量组肺组织、血清中SOD含量均显著升高(P<0．05)，芪蛭大、中剂量组肺组织中MDA含量均显著降低p<O．05)，芪蛭大、小剂量组血清中MDA含量均显著降低P<O．05)，芪蛭大、小剂量组肺组织中NO含量显著升高(P<0．05)，芪蛭大、中剂量组血清中N0含量显著升高(P<O．05)。提示芪蛭皱肺颗粒调节N0代谢及提高抗氧化能力可能是其防治COPD的作用机制之一。

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