正交试验法优选旋覆花提取工艺研究

    旋覆花为菊科植物旋覆花(Inula japonica Thunb．)或欧亚旋覆花(Inula britnnica L．)的干燥头状花序”。我国分布广泛，味苦、辛、咸，微温。《本草备要》云：“入肺、大肠经，消痰结坚痞，唾如胶漆，噫气不除。”临床用于风寒咳嗽，痰饮蓄结，胸膈痞闷，喘咯痰多，呕吐噫气，心下痞硬。花质虽轻，却以降为能，既降肺气又降胃气，故前人有“诸花皆升，旋覆独降”之说。本文根据旋覆花中有效成分的理化性质  等，采用正交试验法，以绿原酸含量和浸膏得率为指标，优选旋覆花的最佳提取工艺。
    仪器和材料
1  仪  器    
    Waters600高效液相色谱仪(600泵，2487检测器，Millennium32工作站)；Kromasil C18色谱柱(4．6mm×250mm，5．0um)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；AG285型电子天平(德国赛多利斯)；电热套(南通市长江光学仪器有限公司)；KQ3200DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。
2药材及试剂
    旋覆花(安徽中医学院第一附属医院中药库提供，批号20110507，产自河南，经医院李立华主任药师鉴定符合《中国药典》2010版一部规定)。绿原酸对照品(含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号110753—200413)。乙腈(色谱纯，美国Tedia 公司)，其他均为分析纯，水为重蒸水并经0．21xm滤膜过滤。
    方法与结果
1绿原酸的HPLC测定
1．1  色谱条件  Kromasil c18色谱柱(250ram×4．6mm，5．0um)；流动相为乙腈一0．4％磷酸水溶液(15：85)；柱温30~C；检测波长327nm；流速1．0ml／min；进样量201ul，在该色谱条件下，样品中绿原酸峰与其他非被测成分峰能够达到基线分离，对照品与样品色谱图
 
1．2对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品2．04mg，置10ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(含绿原酸0．204mg／ml，10~(2以下保存)。
1．3供试品溶液的制备  称取干浸膏0．1g，置lOml容量瓶中，精密加入50％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用0．2um微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。    •
1．4标准曲线的制备吸取对照品溶液(0．204mg／m1)4ul, 8ul、12ul、16ul、20ul、24ul 分别进样，按拟定色谱条件测定，记录峰面积值。以峰面积Y为纵坐标，进样量x为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=3054473．3X一278872，r=0．9997。表明绿原酸在O．816～4．896~g与峰面积呈良好线性关系。
1．5精密度试验精密吸取绿原酸对照品溶液(0．204mg／m1)20ul按照上述色谱条件，连续进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD为0．57％，表明仪器精密度良好。1．6稳定性试验精密吸取同一样品溶液分别在放置0、2、4、8、12、24h后进样，测定其峰面积值，结果RSD为0．42％，表明样品在24h内具有良好的稳定性。
1．7重复性试验精密称取样品6份，按2．1．3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样20ul测定峰面积，结果RSD为0．66％，表明方法重复性良好。
1．8样品含量的测定取正交试验所得干浸膏制备的9份供试品溶液，各精密吸取20ul分别进样分析，测定峰面积，每份供试品溶液测定2次，取2次测得峰面积的平均值，计算含量。
1．9加样回收率实验取已测定含量的样品(绿原酸含量为0．973mg／g)粉末6份，每份0．1g左右，精密称定，置于10．0ml具塞锥形瓶中，分别加入浓度为0．204mg／ml的绿原酸对照品溶液0．45ml(1ml移液管加样)，按
“1．3项下”制备供试品溶液，进样20ul按“2．1．1项下”色谱条件测定，分别计算加样回收率，结果回收率为100．45％，RSD为1．28％。见表1。
 
3浸膏得率的测定
    取相当于10g药材的提取液置于干燥至恒重并精密称定的蒸发皿中，水浴蒸干，减压干燥至恒重，精密称定，计算浸膏得率，结果见表3。
4正交试验结果
    按照L9(3。)正交表安排试验，去旋复花药材50g，置于圆底烧瓶中，分别加入相应体积分数的乙醇与药材混合，回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩成膏，干燥，即得样品。HPLC分别对正交试验所得的干浸膏中绿原酸进行含量测定，计算绿原酸的提取率，结果见3，方差分析结果见表4、表5。绿原酸提取率=干膏中的质量／旋复花饮片中的质量。
4．1正交试验结果见表3，方差分析结果见表4、5。
 
    结合表2、表3及表4，由以浸膏得率为考核指标结果可知，各因素作用主次为c>A>D>B，其中C因素影响具有显著性意义，确定A281C3D3为最佳；由绿原酸提取量为考察指标结果可知，各因素作用主次为c>A>D>B，以A381c2D1为佳；考虑到节能省时、降低消耗和尽量提取有效成分，最终确定最佳工艺为A281C2D1，即10倍量70％乙醇回流1．5h，提取2次。4．2工艺验证按最佳提取工艺A381C2D1进行验证试验(平行3次)，提取液绿原酸平均含量为1．418mg／g，干侵膏得率13．76％，RSD=3．55％，说明工艺合理，提取较完全，稳定性好。
    讨  论
    在流动相选择上，文献[4]中大多是乙腈：0．4％磷酸(10：90)，但考虑于出峰时间的问题，增大乙腈的量，经多次预试验，当乙腈一0．4％磷酸(15：85)时，出峰时间在lOmin左右，故均以此为流动相。在样品中的绿原酸含量测定时，曾用甲醇提取后用乙腈：0．4％磷酸(15：85)为流动相，直接进行高效液相测定，结果分离效果不好，绿原酸色谱峰拖尾严重。在查阅多篇文献之后，重新用50％甲醇提取后，结果发现分离效果较好，拖尾现象明显得到改善。
    绿原酸对光较敏感，长时间光照易分解，因而实验中绿原酸对照品与样品均应采用棕色量瓶放置，保存IO°C以下。稀释液不宜长期保存，最好现配现用。
    绿原酸高效液相色谱法测定波长有330、327、325nm等文献报道"J。将绿原酸对照品溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，以二极管阵列检测器进行测定，得到它们的色谱扫描图及光谱吸收曲线。绿原酸对照品、旋覆花供试品所含绿原酸的光谱吸收曲线相一致，均在327nm左右有最大吸收，故确定327nm为检测波长，供试品与绿原酸对照品在相应位置上有相似的吸收峰且分离度良好。
    结    论
    本实验对旋复花有效成分绿原酸的提取提供了最佳工艺条件，结果表明，本工艺稳定、切实可行，且所得有效成分的提取率较高。

(如果您认为转载内容侵犯了您的权益，请及时联系我们，本网站将在收到信息核实后24小时内删除相关内容。)