高效液相色谱法测定养血愈风颗粒中芍药苷含量
核心提示： 养血愈风颗粒是由白芍、熟地黄、当归、山茱萸、枸杞子等中药组成的院内复方制剂(成都中医药大学附属医院，原剂型为汤剂)，具有滋阴养血、抗炎止痒之功效，并能改善局部血液循环，提高机体免疫功能Ⅲ，主要用于治疗外阴营养不
养血愈风颗粒是由白芍、熟地黄、当归、山茱萸、枸杞子等中药组成的院内复方制剂(成都中医药大学附属医院，原剂型为汤剂)，具有滋阴养血、抗炎止痒之功效，并能改善局部血液循环，提高机体免疫功能Ⅲ，主要用于治疗外阴营养不良等妇科疾病。白芍为该颗粒剂主药之一，其主要有效成分为芍药苷。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)对芍药苷的含量进行测定，进而为制定该制剂的质量标准提供依据。
1仪器与试药
Agi lent 1200型高效液相色谱仪；Sartorius BS210S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；Mettler Toledo超越系列专业型xs分析天平，梅特勒一托利多(上海)有限公司；KQ
3200 E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
芍药苷对照品，中国药品生物制品检定所提供，批号Ii0736-201035，供含量测定用；养血愈风颗粒，成都中医药大学附属医院提供，批号20111219、20120225、20120312、20120316。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1色谱条件
色谱柱：Dikma Diamonsil C18柱(250 mm~4．6mm5 pm)；流动相：乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)；检测波长：230 nm：流速：1．O nlL／min：柱温：30℃；进样量：10 uL。理论塔板数按芍药苷峰计不小于3 000，且分离度R>1．5。
2．2对照品溶液的制备
取芍药苷对照品(对照品用前经60℃减压干燥4 h处理)适量，精密称定，加甲醇制成每1 InL含61．2ug的溶液，作为对照品溶液。
2．3供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品颗粒约0．5 g，精密称定，置50 IIlL具塞量瓶中，加甲醇35 IDL，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 rain，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液并用微孔滤膜(O．45um)滤过，即得供试品溶液。
2．4阴性对照溶液的制备
按处方比例，取除白芍外的其他药材，照养血愈风颗粒生产工艺制备阴性样品制剂，再按“2．3”项下方法制成阴性对照溶液。
2．5专属性考察试验
分别精密量取空白溶剂、对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10uL按照上述色谱条件，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图。结果供试品色谱中与芍药苷对照品相同保留时间处有色谱峰，阴性对照色谱在相应位置处无色谱峰出现，
注：A．空白溶剂(甲醇)；B．对照品；c．阴性对照；D．供试品
图1养血愈风颗粒HPLC图
2．6线性范围考察
分别精密量取对照品溶液(61．2 ug／InL)2、4、6、8、10、20 uL注入液相色谱仪，测定峰面积。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标、进样量(ug)为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y =1 131．6X+50．762，r=0．999 9。结果表明，芍药苷进样量在0．122 4～1．224 pg范围内呈现良好的线性关系。
2．7精密度试验
精密量取上述对照品溶液10uL，平行进样6次，测定芍药苷峰面积积分值，测定结果RSD=O．69％(n=6)，表明仪器的精密度良好。
2．8稳定性试验
取同一批号的供试品颗粒(批号20120312)，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、20、24 h进样测定，记录峰面积值，测得供试品中芍药苷的峰面积RSD=2．32％(Jr7=6)，表明供试品在24 h内稳定。
2．9重复性试验
精密称定同一批号的供试品颗粒(批号20120312)，按“2．3”项下方法制备供试品溶液5份，并按上述色谱条件进行测定，测得芍药苷平均含量为7．52 mg／g，RSD=0．64％(月=5)。结果表明本法具有较好的重复性。
2．10加样回收率试验
取已知含量的养血愈风颗粒约0．28 g，精密称定6份，分别精密加入一定量的芍药苷对照品，按“2．3”项下方法制备，照上述色谱条件进行测定，用外标法计算回收率，结果平均回收率为98．85％，RSD=1．66％(力=6)，结果见表1。
2．11样品含量测定
取不同批号的养血愈风颗粒约O．1 g，精密称定，按“2．3”项下方法分别平行制备供试品溶液3份，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 u L，注入液相色谱仪，记录色谱图，并按照外标法计算样品中芍药苷的含量，结果见表2。
3讨论
本试验考察了回流提取、超声提取以及温浸提取3种提取方法，结果超声提取法明显优于回流提取法与温浸提取法；进而分别考察了提取溶剂(甲醇、无水乙醇、稀乙醇)、提取溶剂用量(25、35、50 m L)、提取时间(20、30、40 min)对芍药苷提取效果的影响，结果发现甲醇的提取率明显高于无水乙醇和稀乙醇 ，且采用甲醇35 mL、超声提取30 min时，即能将样品中芍药苷提取完全。
参考相关文献[3-4]，本试验对流动相种类及比例进行了考察，分别按照乙腈一水(20：80)、乙腈一0．1％磷酸水溶液(20：80)、乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)进行洗脱。结果显示，采用乙腈一水(20：80)洗脱，芍药苷峰分离度较差、拖尾现象严重且基线不平稳 ；采用乙腈一O．1％磷酸水溶液(20：80)洗脱，芍药苷峰保留时间明显缩短，但是峰型较差且对称因子也不符合要求：采用乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)洗脱，主峰峰型得到明显改善且分离度较好，杂峰集中，基线平稳，故优选乙腈一0．1％磷酸水溶液(14：86)为流动相。
本试验采用HPLC测定养血愈风颗粒中芍药苷的含量，由方法学考察可见，该方法精密度高，稳定性和重复性好，阴性无干扰且回收率较理想，故本法简便、灵敏、准确，为该颗粒剂质量控制提供了一定依据。
1仪器与试药
Agi lent 1200型高效液相色谱仪；Sartorius BS210S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；Mettler Toledo超越系列专业型xs分析天平，梅特勒一托利多(上海)有限公司；KQ
3200 E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
芍药苷对照品，中国药品生物制品检定所提供，批号Ii0736-201035，供含量测定用；养血愈风颗粒，成都中医药大学附属医院提供，批号20111219、20120225、20120312、20120316。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1色谱条件
色谱柱：Dikma Diamonsil C18柱(250 mm~4．6mm5 pm)；流动相：乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)；检测波长：230 nm：流速：1．O nlL／min：柱温：30℃；进样量：10 uL。理论塔板数按芍药苷峰计不小于3 000，且分离度R>1．5。
2．2对照品溶液的制备
取芍药苷对照品(对照品用前经60℃减压干燥4 h处理)适量，精密称定，加甲醇制成每1 InL含61．2ug的溶液，作为对照品溶液。
2．3供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品颗粒约0．5 g，精密称定，置50 IIlL具塞量瓶中，加甲醇35 IDL，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 rain，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液并用微孔滤膜(O．45um)滤过，即得供试品溶液。
2．4阴性对照溶液的制备
按处方比例，取除白芍外的其他药材，照养血愈风颗粒生产工艺制备阴性样品制剂，再按“2．3”项下方法制成阴性对照溶液。
2．5专属性考察试验
分别精密量取空白溶剂、对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10uL按照上述色谱条件，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图。结果供试品色谱中与芍药苷对照品相同保留时间处有色谱峰，阴性对照色谱在相应位置处无色谱峰出现，
注：A．空白溶剂(甲醇)；B．对照品；c．阴性对照；D．供试品
图1养血愈风颗粒HPLC图
2．6线性范围考察
分别精密量取对照品溶液(61．2 ug／InL)2、4、6、8、10、20 uL注入液相色谱仪，测定峰面积。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标、进样量(ug)为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y =1 131．6X+50．762，r=0．999 9。结果表明，芍药苷进样量在0．122 4～1．224 pg范围内呈现良好的线性关系。
2．7精密度试验
精密量取上述对照品溶液10uL，平行进样6次，测定芍药苷峰面积积分值，测定结果RSD=O．69％(n=6)，表明仪器的精密度良好。
2．8稳定性试验
取同一批号的供试品颗粒(批号20120312)，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、20、24 h进样测定，记录峰面积值，测得供试品中芍药苷的峰面积RSD=2．32％(Jr7=6)，表明供试品在24 h内稳定。
2．9重复性试验
精密称定同一批号的供试品颗粒(批号20120312)，按“2．3”项下方法制备供试品溶液5份，并按上述色谱条件进行测定，测得芍药苷平均含量为7．52 mg／g，RSD=0．64％(月=5)。结果表明本法具有较好的重复性。
2．10加样回收率试验
取已知含量的养血愈风颗粒约0．28 g，精密称定6份，分别精密加入一定量的芍药苷对照品，按“2．3”项下方法制备，照上述色谱条件进行测定，用外标法计算回收率，结果平均回收率为98．85％，RSD=1．66％(力=6)，结果见表1。
2．11样品含量测定
取不同批号的养血愈风颗粒约O．1 g，精密称定，按“2．3”项下方法分别平行制备供试品溶液3份，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 u L，注入液相色谱仪，记录色谱图，并按照外标法计算样品中芍药苷的含量，结果见表2。
3讨论
本试验考察了回流提取、超声提取以及温浸提取3种提取方法，结果超声提取法明显优于回流提取法与温浸提取法；进而分别考察了提取溶剂(甲醇、无水乙醇、稀乙醇)、提取溶剂用量(25、35、50 m L)、提取时间(20、30、40 min)对芍药苷提取效果的影响，结果发现甲醇的提取率明显高于无水乙醇和稀乙醇 ，且采用甲醇35 mL、超声提取30 min时，即能将样品中芍药苷提取完全。
参考相关文献[3-4]，本试验对流动相种类及比例进行了考察，分别按照乙腈一水(20：80)、乙腈一0．1％磷酸水溶液(20：80)、乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)进行洗脱。结果显示，采用乙腈一水(20：80)洗脱，芍药苷峰分离度较差、拖尾现象严重且基线不平稳 ；采用乙腈一O．1％磷酸水溶液(20：80)洗脱，芍药苷峰保留时间明显缩短，但是峰型较差且对称因子也不符合要求：采用乙腈一O．1％磷酸水溶液(14：86)洗脱，主峰峰型得到明显改善且分离度较好，杂峰集中，基线平稳，故优选乙腈一0．1％磷酸水溶液(14：86)为流动相。
本试验采用HPLC测定养血愈风颗粒中芍药苷的含量，由方法学考察可见，该方法精密度高，稳定性和重复性好，阴性无干扰且回收率较理想，故本法简便、灵敏、准确，为该颗粒剂质量控制提供了一定依据。
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