黄芩苷对氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡的防护作用
研究表明，低密度脂蛋白(Low Density Lipopr0—tein，LDL)增高是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的重要危险因子，而LDL经过氧化修饰，形成氧化修饰低密度脂蛋白(OX．LDL)，则具有更强的致AS作用。大量体外实验证明，oxLDL可通过多条途径诱导血管内皮细胞过度凋亡。寻找防止脂蛋白氧化修饰的药物，特别是天然抗氧化剂，对AS的防治具有重要意义。黄芩苷是普遍存在于自然界中的黄酮类化合物，具有抗脂质氧化，降低血脂，降低血压，抗炎等作用，目前已被广泛运用于心脑血管病的治疗。我们应用LDL诱导大鼠血管内皮细胞凋亡的体内模型，观察黄芩苷对其干预作用，研究黄芩苷是否可抑制OX-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡并探讨其可能机制。
1 实验材料
1．1 试剂与药品 黄芩苷由北京协和药厂生产，TUNEL检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，组织半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性比色法定量检测试剂盒为美国Santa Cruz产品，台盼蓝及多聚甲醛购自北京化学试剂公司。
1．2 LDL的制备 取正常人空腹12h血浆，4°C，1200r／min离心30min，去除乳糜微粒；溴化钠铺梯度，两步超速离心法分离低密度脂蛋白(LDL)，0．45um滤纸过滤除菌，4℃保存，Lowry法测蛋白浓度。
2实验方法
2．1 实验分组和动物模型制备雄性Sprague-Dawley大鼠36只，2009左右，随机分为3组。对照组：0．85％氯化钠溶液1mL／d灌胃4周，第3周后尾静脉注射0．85％氯化钠溶液2mL(k9·d)1周；LDL组：0．85％氯化钠溶液1mL／d灌胃4周，第3周后尾静脉注射LDL8mg(k9·d)1周；黄芩苷组：20m9／(k9·d)灌胃4周，第3周后尾静脉注射LDLSm9／(k9·d)1周。
2．2血管内皮细胞铺片的制备大鼠模型制备后，每组随机取6只麻醉后打开胸腔，插管至左心室腔，灌注PBS，右心房排出液清亮后，换4％多聚甲醛PBS液(pH7．2)灌注5min；分离全段主动脉，4％多聚甲醛固定4h，将主动脉纵行剖开，内皮面朝下压贴于火棉胶玻片上，揭下血管壁内皮细胞则粘贴于火棉胶上；浸入蒸馏水中，将脱落火棉胶转贴于明胶玻片上，烤片后风干保存，每只大鼠4张铺片，用于凋亡检测。
2．3 凋亡细胞检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核中的DNA3-0H末端，DAB显色，甲基绿复染，每一样本4张铺片，每张铺片观察5个视野，计数每一视野(×200)阳性凋亡细胞数，取均值代表每一样本数．
2．4 Caspase．3酶活性测定 采用比色法caspase-3colorimetric assay测定caspase．3酶活性，每组大鼠随机取6只，快速分离主动脉，4。C PBS液冲洗，内翻主动脉；PBS液中轻轻刮取内皮层，研磨后，40C，300r／min离心lomin，弃上清液；加细胞裂解缓冲液，置冰上30min；1000r／min离心lmin，取上清液，96孔平底微孔板上进行反应，依次加入反应物1OOpl(设置阴性对照，微孔内加PBSl001x1)，2x反应缓冲液lOOpd，比色反应底物(DEVE—pNA)10l，370C孵育2h，Elx 800 Uni—versa[Microplate Reader(Bio-TEK INSTRUMENTS INC)测波长405nm的吸收度(A405nm)，A405nm表示caspase-3酶活性。
3实验结果
3．1 凋亡细胞计数 正常大鼠血管内皮细胞核呈均匀淡蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一棕褐色，对照组、LDL组、黄芩苷组大鼠每一视野下凋亡细胞数分别为12．01-I-2．03、92．33±14．68、26．48±8．16。LDL组与对照组比较凋亡细胞显著增多(P<0．01)；黄芩苷组与LDL组比较，凋亡细胞显著减少(P<0．01)。
3．2 Caspas．3酶活性变化对照组、LDL组、黄芩苷组大鼠血管内皮细胞A405min分别为0．028±0．006，0．092±0．008，0．036±0．005。LDL组A405nm较对照组显著增高(P<0．01)，黄芩苷组较LDL组显著降低(P<0．01)，表明LDL可通过激活caspase-3这一凋亡效应酶诱导大鼠血管内皮细胞凋亡，黄芩苷可抑制这一酶的活性而抑制凋亡。
4讨论
细胞凋亡的现象广泛存在于心脑血管疾病的发生发展过程中，是细胞损伤的特征性病理生理变化，因此，干预细胞凋亡保护心脑血管已成为当今心脑血管药理的一个新的发展方向。内皮细胞是影响血管壁通透性的主要屏障，其在调节心血管功能、维持心血管稳态中发挥重要作用。研究表明氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的毒性作用在动脉粥样硬化形成中占有重要的地位。在心脑血管系统疾病中，心肌炎、心肌梗死、充血性心力衰竭、心脑缺血再灌注损伤、帕金森综合征中普遍存在细胞凋亡异常现象，因此，研究中药对于细胞凋亡影响的研究有重要意义。黄芩苷有清除自由基抗氧化干预细胞凋亡等作用，在心血管疾病防治中具有潜在的开发价值。黄芩苷在心血管疾病的治疗与预防上有很多应用，许多实验证明，黄芩苷可以影响神经细胞、血管内皮细胞、心肌细胞及血管平滑肌细胞的凋亡。已有的研究提示黄芩苷的作用可能与Bcl家族P53、fas、fos等凋亡调控因子有关，与caspase-3信号传递途径有关。Caspases蛋白酶级联切割反应在细胞凋亡过程中发挥重要的作用，而Caspase-3又处于级联反应的核心位置，是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。本研究发现黄芩苷可以明显抑制氧化损伤条件下内皮细胞Caspase-3的表达，此作用可能是其抗凋亡分子机制中的一个重要环节。细胞凋亡的调控是十分复杂的，黄芩苷的影响位点及作用途径可能还涉及许多其他的基因和调控因子，这些问题的揭示将会对相关疾病的预防及治疗有积极意义。
研究结果显示LDL可能通过激活caspase-3这一凋亡效应酶诱导大鼠血管内皮细胞凋亡，为黄芩苷治疗新的适应症提供了理论线索，为心血管系统疾病特别是动脉粥样硬化的防治提供了科学的理论依据。
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