以ABC膜转运蛋白为靶点的中药逆转肿瘤多药耐药的研究现状
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康，每年因其死亡的人数位居各类疾病死因的首位。肿瘤死亡率高的原因在于其难发现、难治愈、易复发。而肿瘤细胞的多药耐药正是肿瘤难治愈的主要原因之一。肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他许多结构各异、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象。肿瘤细胞多药耐药严重地影响了化疗药物的效果及疾病预后。研究发现，MDR的出现与肿瘤细胞内药物聚集降低有关，表明药物转运的改变可能是产生耐药的原因之一。其中ABC转运蛋白超家族(ArllP-binding cassettetransporter superfamily)成员介导的药物外排在MDR中起了重要作用，也是目前国内外研究的热点之一，中医药以药物转运蛋白为靶点进行了大量的逆转肿瘤多药耐药研究。本文就ABc膜转运蛋白介导的多药耐药中药逆转现状作一综述。
1 转运蛋白介导的肿瘤多药耐药机制
1．1 ABC膜转运蛋白超家族成员
ABC转运蛋白超家族是人类最大的转运蛋白基因家族，编码产物是一组跨膜蛋白，即ABC转运蛋白。ABC转运蛋白家族成员均含有保守的ABC结构域，参与ATP的结合和水解过程。目前发现人类共有49个ABC转运蛋白，共分为7个亚家族；该家族参与肿瘤多药耐药的主要成员为ABCB、AB-CC、ABCG等亚家族，其中最重要的药物相关ABC转运蛋白包括多药耐药蛋白(P-glycoprotein，P—gP)、多药耐药相关蛋白(muhidrug resistance protein，MRPl)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistanceprotein，BCRP)。ATP结合盒膜转运蛋白超家族成员，具有药泵功能，其转运的底物包括：糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白、大量的疏水化合物以及细胞代谢产物和药物等，这些转运蛋白以主动转运方式完成多种分子的跨膜转运，将化疗药泵出肿瘤细胞外，减少细胞内药物的积聚引起耐药。国内外对P．gP的研究数量最多，范围最广，BCRP的研究最少。
1．1．1 P．gP介导的肿瘤MDR
由P．gP介导的药物外排是产生MDR的一个主要机制之一。20世纪60年代，Kessel首先在抗长春新碱的P388鼠白血病细胞株中发现了多药耐药现象。1970年Biedle首先发现仓鼠卵巢细胞接触抗癌药物后，可获得耐药，并有交叉耐药，称之为多药耐药。l976年Julian0首次在抗秋水仙碱的中国仓鼠卵巢细胞株的质膜上，发现了一种与膜通透性有关、分子量为170KD的糖蛋白，并将他命名为P-糖蛋白(permeability-glycoprotein，P—gP)，1987年ue-da等通过实验证实P．gP是MDR基因编码的产物，由约l280个氨基酸组成，是一种能量依赖性药物输出泵，与耐药有关。与P．gP有关的产生MDR的药物一般是天然来源和疏水性药物，如长春生物碱类和阿霉素(ADM)，也包括一些合成药物(如米托蒽醌)。这种由P．gP介导的多药耐药称为典型多药耐药(t．MDR)。临床研究证实肿瘤细胞P-gP高表达常提示患者预后不良，且其可作为评价肿瘤患者预后的指标。Yeh临床研究表明P．gP的表达与初治小细胞肺癌(SCLC)患者化疗效果相关，高表达与低表达P．gP的患者疗效有明显差异。
1．1．2多药耐药相关蛋白(MRP)介导的MDR
MRP是1992年由Krishnamachary等在耐药人小细胞肺癌细胞系H69AR中发现的另一种转运蛋白，其相对分子量为190KD，含l531个氨基酸残基，编码MRP的基因定位于染色体16q13．1 MRP与P一印有某些相似之处，属于ABC家庭，两者有l5％的氨基酸序列相同，但MRP与P—gP转运底物明显不同。MRP能识别和转运与谷胱甘肽(GSH)耦合的底物如VP-16、柔红霉素和顺铂(DDP)等，故又称为Gs-X泵。MRP转运的步骤可能为：GSH合成一GSH与药物藕合MRP将药物泵出细胞外。另外。MRP还能影响细胞内药物的分布，使药物局限于核周囊泡。呈房室分布，难以进入核内发挥细胞毒作用。
1．1．3乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的MDR
1998年Doyle等首先从MCF一7／AdrYp细胞中克隆出该耐药基因的cDNA，该基因编码一种含655个氨基酸残基，72．6KD大小的跨膜转运蛋白，因该蛋白首先从乳腺癌细胞中被发现，故被称为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。BCRP是一个不完全转运分子，故称为半转运蛋白。最近研究发现BCRP在各种耐药细胞的细胞膜上过度表达，成为半转录体中唯一在细胞膜上表达的蛋白。它可能与细胞膜上的未知分子组成异二聚体发挥功能，而不同种类细胞膜未知分子的差异可能影响转运的特异性。研究表明，BCRP表达与白血病、卵巢癌、乳腺癌的临床化疗敏感性有关，且与P-gP、MRP的表达水平无相关性。BCRP产生耐药机制与P—gP相同，即通过水解ATP获得能量使药物排出细胞，应用BCRP抑制剂GFl20918可以有效降低拓扑林肯清除率，提高其在肿瘤细胞内浓度，使原先耐药细胞恢复敏感性。
2中药逆转现状
近年来为了寻找低毒有效的肿瘤多药耐药逆转剂，研究人员用中药及其提取成分体外直接作用于肿瘤细胞，以ABC膜转运蛋白为靶点进行了大量的研究。
2．1 P-gP
2．1．1 抑制MDRl基因及P—gp表达
曹存梅等在临床使用生脉注射液(由红参、麦冬、五味子组成)联合姑息化疗，治疗耐药性晚期结肠癌，通过检测患者外周血港巴细胞膜P-gP含量，临床对比观察对晚期结肠癌眵药耐药性的逆转作用，其结果显示外周血淋巴细胞膜含量与治疗前比较，生脉组明显低于化疗组；夕阳血淋巴细胞膜P-gP转阴率，化疗组为7．00％，生脉组为36．00％。两组比较，生脉组转阴率明显高于化疗组，P<0．01；临床疗效比较表明，生脉组的总有效率、中位生存期和1年生存率都比化疗组高，两组间比较具有显著差异。谢勇等研究发现，加入参麦注射液的K562／ADM细胞对阿霉素的抗药性具有部分的逆转效果，并且具有一定的剂量依赖性。其逆转机理与部分下调细胞膜表面p-糖蛋白的高表达有关。
李起等使用中药复方肝癌-1号(茯苓、白术、黄芪、茵陈提取液)逆转肝癌多药耐药的实验，研究表明肝癌-1号对HepG2／ADM细胞无明显毒性，可部分抑制HepG2／ADM细胞P-gP合成及MDRlmRNA的表达，逆转HepG2／ADM的耐药性，对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3．94倍、1．72倍、1．67倍。结果表明肝癌-1号通过抑制HepG2／ADM耐药细胞MDRl mRNA的表达及P-gP合成，能部分逆转HepG2／ADM的耐药性。许建华等发现肠胃清(黄芪、党参、白术等)药物血清对多药耐药细胞KB．A．1的P．gP的ATP酶活性具有抑制作用，并呈剂量依赖性；2．5和5药物血清对MDR1基转录水平的抑制作用分别达到了58和100。提示肠胃清逆转肿瘤耐药与其抑制P．gP的酶活性、降低MDRl mRNA表达有关。
黄程辉等在急性难治、复发白血病患者为研究对象的临床研究中，使用人含药血清对患者骨髓制成的单细胞悬液进行实验研究发现，拮新康能抑制耐药白血病细胞增殖，并通过降低耐药白血病细胞P．gp的表达逆转MDR。六神丸具有清热解毒、止痛消炎的作用，史哲新等使用六神丸临床观察其逆转白血病细胞多药耐药作用发现，治疗前后组间比较，P-gP阳性表达例数、阳性表达率以及表达指数，治疗组均明显低于对照组，两者有显著性差异，表明六神丸可以通过降低P—gP的表达来逆转白血病细胞多药耐药。张亚莉等采用MlTr比色法、RT．PCR检测等研究三氧化二砷(As203)诱导白血K562／ADM耐药细胞凋亡的分子机制，结果发现As203显著抑制K562／ADM耐药细胞的增殖，mdrl mRNA表达和P-gP合成明显降低。
李贵海等探讨不同生物碱对小鼠Sl80肉瘤细胞获得性多药耐药相关生物因子表达的干预实验结果表明：苦参碱、粉防己碱明显降低化疗诱导后耐药细胞P-gP、LRP的表达率和TOPO Il活性，增加凋亡基因Fas表达率，促进耐药肿瘤细胞的凋亡；而氧化苦参碱和盐酸小檗碱作用不明显，提示苦参碱、粉防己碱可通过对MDR相关生物活性物质的调节，干预化疗诱发MDR的产生，并且其作用程度与生物碱的结构相关。郭霞等用体外培养方法，观察黄芩苷体外对氟尿嘧啶(Fu)耐药肝癌细胞株生长的影响，发现黄芩苷明显抑制肝癌细胞BEL．7402及其耐药细胞BEL-7402／5．Fu的增殖，lom9／L黄芩苷增加耐药细胞内药物积聚，降低MDRl基因及P．gP蛋白表达。
2．1．2抑制P—gP功能
廖斌等采用MT法、流式细胞术研究中药复方君子(FFJZ)联合环孢霉素A(cyclosporineA，CsA)逆转白血病耐药细胞K562／VCR耐药性的作用。检测发现，无论CsA和FFJZ单独或联合对K562／VCR细胞P—gP表达的阳性率均无明显影响。推测CsA和FFJZ并不是通过抑制K562／VCR细胞MDRl／P—gP的表达，而是通过抑制P．gP的功能增加细胞内药物积聚而达到逆转耐药的作用。
李凌等研究发现转染多药耐药基因(MDRl)的人乳腺癌细胞MCF．7／MDR表现为P糖蛋白高表达，对阿霉素、长春新碱、紫杉醇、高三尖杉酯的抗药性均增加；五味子乙素(SchB)(25txmoL／L)显著减少阿霉素、长春新碱、紫杉醇和高三尖杉酯对MCF-7／MDR细胞的IC50，逆转倍数达6．03～23．94倍；但SchB(25mol／L)不影响MCF-7／MDR细胞的P．gl)表达。提示SchB能有效逆转转染MDRl的MCF-7细胞的多药耐药，其机制可能是抑制了P．gp的药物外排生物学活性。
立彦等研究中药人参皂甙Rbl在多药耐药(MDR)逆转中的作用，研究显示：Rbl 801xM时，细胞存活95．47％，存活81．43％，对照组96．9％，因此选择801山M为实验剂量。在药敏实验中，801人参皂甙Rbl组IC50约在0．491x9／ml，不加药组IC50约在1．3g／ml，用药前细胞耐药倍数为335．8倍，用药后耐药倍数为126倍，人参皂甙Rbl的逆转倍数为2．65倍，流式结果显示，破膜前给药组细胞膜表面的Pgp含量明显低于对照组，而破膜后由于细胞内的Pgp释放出来，则二组的表达差异不大，说明可以通过人鑫皂甙Rbl抑制P—gP的功能，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。王天晓等以白血病多药耐药细胞(K562／ADM)为对象，研究从中药功劳木中提取、分离出来的异喹啉类生物碱组分(Fraction 6，F6)逆转肿瘤MDR的效果及作用机制。研究表明F6能有效逆转白血病细胞的MDR；F6逆转白血病MDR的机制为通过抑制肿瘤细胞膜上P-gP的药泵功能，增加耐药细胞内化疗药物浓度逆转耐药性，而不是抑制MDRl基因和P-gP表达。他们另一项研究探讨中药十大功劳中异汉防己碱对白血病K562／DOX细胞多药耐药性(muhidrug resistance，MDR)的逆转作用。发现异汉防己碱在1O9／ml的无毒剂量下可明显增强DOX的细胞毒性，RF=4．86，明显高于维拉帕米(RF=2．65)的逆转活性(P<0．05)；K562／DOX细胞膜上P-gP呈强阳性表达，但异汉防己碱对该P-gP表达水平无明显影响；异汉防己碱使细胞内Rhl23和DOX的浓度明显增加。异汉防己碱可能通过抑制P．gP功能而有效逆转白血病细胞的多药耐药性，它有望成为肿瘤多药耐药逆转剂的候选药物。
2．2 MRP
曹勇等研究结果显示，补肾化瘀解毒方药物血清具有明显抑制肺癌A549／DDP耐药细胞MRP的表达，补肾化瘀解毒方药物血清可通过降低化疗药物在耐药细胞内的浓度和分布，发挥对肺癌A549／DDP耐药细胞的耐药逆转，其机制可能与其抑制肺癌耐药细胞MRP的表达有关。
陈春美等发现中药榄香烯能显著降低ADM对胶质瘤细胞耐药株U251／ADM细胞的IC50，从0．915m9／L到0．051m9／L，明显增加细胞内药物浓度，联合Elemene浓度的增加，G0／Gl期细胞减少，G2／M期细胞增加。MRP和GST基因表达均显著下降(P<0．05)，TOP0ⅡOf．表达差异无统计学意义(P>0．05)。说明榄香烯具有逆转U251／ADM细胞耐药性的作用，可能与抑制耐药基因MRP和GST的表达有关。
陈小红等选K562／Adr耐药细胞株作为靶细胞，采用MTT法、RT-PCR的方法，研究发现葛根素注射液在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖，并能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性，其机制可能通过对耐药相关基因(MDRl、MRP)表达抑制来起作用。
槲皮素，化学名为3，3'，4'，4，52五羟黄酮，是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于中药和水果中。具有诸多方面的生理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等。杜方兵等通过体外细胞实验发现槲皮素可以逆转KB2MRP的多药耐药，逆转效果与剂量相关，逆转机制可能与MRPl的表达下调有关。刘文林等研究槲皮素联合survivin反义核苷酸对肝癌SMMC7721／ADM细胞MDR的逆转作用，槲皮素与ASODN联合能明显逆转SMMC7721／ADM细胞对四种化疗药物的耐药性。槲皮素可能通过抑制MDRlmRNA和MRPmRNA的表达使p170和pl90的合成减少而发挥耐药逆转作用，ASODN不能通过该途径发挥作用。
李玲等用流式细胞仪检测五味子乙素(SchB)对表达MRPl的肿瘤耐药细胞株的逆转耐药作用，发现其可有效降低HL60／ADR、HL60／MRP对DNR、长春新碱(VCR)和VPl6的IC50，逆转倍数2倍到20倍不等；SchB能够增加DNR和MRPl特异性底物CFDA在细胞内的积聚。SchB可以逆转不同化疗药物对MRPl介导的耐药，其逆转机制与增加化疗药物的积聚能力有关。
徐萌等研究中药汉防己提取的生物碱汉防己甲素逆转肺癌化疗耐药产生与凋亡发生的机理。发现汉防己甲素可以逆转GLC．82／ADR耐药肺癌细胞对阿霉素的耐药。化疗耐药肺癌细胞MRP蛋白表达在12h、24h、36h、48h，ADR组与Tet／ADR组比较，差异有非常显著性意义(P<0．01)，说明汉防己甲素可以下调化疗耐药肺癌细胞MRP蛋白表达。并且汉防己甲素协同阿霉素增强对化疗耐药肺癌细胞凋亡作用。
白玉贤等通过确定三氧化二砷(对人大肠癌lsl74细胞的非细胞毒剂量，分别采用生化方法及RT．PCR方法检测非细胞毒剂量下As2O3对人大肠癌lsl74细胞MRP、GST、TOP0．Il表达水平的变化。结果发现As，O，的非细胞毒性剂量(生长率>95％)4．Og／ml，可使人大肠癌lsl74细胞，MRP、GST、TOPO-11表达水平下调。
2．3乳腺癌耐药蛋白(BCRP)
对于乳腺癌耐药蛋白的耐药逆转研究较少，有一些天然药物具有低毒、资源丰富、作用靶点多等特点，比如从白芨的茎中提取物以及食物、植物中提取的类黄酮类物质如染料木黄酮等可增强SN．38对K562／BCRP的细胞毒性，并使拓扑替康在细胞内蓄积。
敬静等研究丹参酮IIA(tffnshin0e IIA)对雌激素受体(ER)阴性人乳腺癌细胞(MB一231)的生长抑制和多耐药逆转作用，发现丹参酮IIA处理后，肿瘤细胞增殖活性降低，半效抑制浓度(IC50)为80ng／mL，且呈时间．剂量．效应关系，进一步研究证实丹参酮IIA对人ER阴性乳腺癌细胞具有生长抑制、凋亡诱导和多耐药逆转作用，其作用机理可能与抑制DNA合成、细胞周期阻滞、及下调多耐药相关基因BCRP／ABCG2表达有关。
中药逆转剂的研究已经有10多年的历史，尽管中药抗肿瘤多药耐药方面取得了不少成绩，但也存在许多不足，如药物谱窄，仅有少数几种单味中药或中药复方；尚无相应系统的理论总结，筛选缺乏针对性；逆转作用靶点较单一，主要集中在经典机制的研究上，主要集中在多药耐药基因及其编码的P-gP，而对于其他耐药蛋白及机制的研究相对较少，不足以充分解释中药逆转MDR的机制；研究主要集中在体外实验，在一定程度上阻碍了中药在逆转MDR方面前进的步伐及其在临床的应用，而对于其在体内的作用效果及安全性也有待进一步的在体研究来验证。鉴于肿瘤MDR产生机制的非单一性使得逆转剂的研究更加复杂，好的逆转剂应安全、有效，对正常组织毒性小，在体内能达到有效浓度，本身具有一定的抗肿瘤活性，分子半衰期较长，而这些特点中药基本都具备，相信随着临床与实验研究资料的积累和相关生命科学理论与技术的发展，中医药一定能在逆转MDR方面将有更大的突破。
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