虎栀合剂防治仪一异硫氰酸萘酯致大鼠急性肝损伤的实验研究

　　婴儿肝炎综合征(In~ncy Hepatitis Sydrome，IHS)是指起病于婴儿时期的一组临床证候群，以黄疸、肝脾肿大及肝功能异常为特点，属中医的“黄疸”“胎黄”范畴。本病病因复杂，大多由病毒、细菌、霉菌或其他病原体感染引起，少数由胆管畸形及先天性代谢障碍引起，其中以病毒感染最为常见。婴儿病毒性肝炎的临床表现与成人不同，多表现为瘀胆型肝炎，胆汁瘀积为其主要的病理改变。HZM是由彭兆麟教授在长期临床实践基础上，结合中西医理论研制的中药复方制剂，临床治疗婴儿肝炎综合征疗效肯定。本实验采取与IHS病变极为相似的ANIT引起的大鼠急性肝损伤模型作为研究对象，探讨HZM的作用及机制，为临床应用提供实验依据。

　　1、材料与方法

　　1.1  实验材料1)实验动物：SD雄性大鼠40只，鼠龄20天左右，体重57.52±1.76g，由同济医科大学动物实验中心提供。2)主要试剂：虎栀合剂，儿童医院药剂科提供；α-异硫氰酸萘酯，美国SIGMA公司提供，临用前用麻油配成2％浓度的溶液；TNF试剂盒，北京东亚免疫研究所提供；MDA试剂盒、SOD试剂盒、双缩脲试剂盒均由南京建成生物工程所提供。3)主要仪器设备：高速冷冻离心机(上海东亭离心机厂)；AU-600全自动生化分析仪；SN-695智能r计数器(上海日环一厂)；0lympus B×50研究摄影显微镜；Leitz 1516石蜡切片机。

　　1.2实验方法 取大鼠40只，随机分成4组：正常对照组(A，N=10)；造模对照组(B，N=10)；HZM治疗组(C，N=10)；泼尼松对照组(D，N=10)。各组均于每日8：00、16：OO灌胃，共4天。A组给予生理盐水 O.5mL／次灌胃。B组除第3天8：00停服生理盐水，改用ANIT(70mg/kg鼠重)灌胃1次，其余方法同A组。 C组给予HZM(20mg/kg)灌胃，第3天早上停服 HZM，而改用ANIT(70mmg/kg)灌胃1次。D组给予泼尼松混悬液2mmg/kg灌胃，第3天早上停服泼尼松混悬液，而改用ANIT(70mmg/kg)灌胃1次。于服用ANIT48h后，即第4天早上8点，断头取血，立即分离血清，在全自动生化分析仪上测定ALT、TBILI、DBI— u、TBA、ALP含量，其余血清一70％冻存，2个月内测定TNF-ot、SOD含量，并于采血后，切取肝右叶的新鲜肝组织一块，常规福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，供光镜下观察。其余肝脏一70~C冻存，2个月内制备组织匀浆，测肝组织MDA含量。

　　血清TNF-ct采用放免法，由武汉市儿童医院核医学室测定。血清SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，按试剂盒说明书要求逐步完成操作。肝组织MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法，按试剂盒说明书要求逐步完成操作。

　　1.3  统计学方法  数据以x(_)±s表示，计量资料用方差分析，方差不齐用H检验，两两比较用Q检验。各变量之间的关系采用直线相关分析。以P<O.05为显著性判断界值。

　　2、实验结果

　　2.1  造模后大鼠一般情况  造模组在造模后24h即开始出现食欲减退，进食减少，食量只有造模前的1／2—1／3，活动减少，巩膜、耳部、尾巴皮肤发黄，小便次数增多，尿色明显变黄，大鼠排泄器官周围被尿液浸湿，至造模后48h表现最为明显。治疗组各种症状均较轻。

　　2.2  各组ALT、TBA、TBILI、DBILI、ALP的组l间比较

   　ANIT造模后48h，造模组、HZM治疗组、泼尼松对照组血清ALT、TBA、TBILI、DBILI、ALP均较正常组明显升高(尸值均<0.01)，但HZM治疗组TBILI、DBILI、 ALT、TBA的升高幅度较造模组明显降低(P<O.05， P<0.01，P<0.01，P<0.01)。与造模组相比，泼尼松对照组TBILI、DBILI亦有显著降低(尸<0.05，P<0.05)，但对ALT、TBA无明显改变(P>0.05)。3组 ALP无明显差异(P>0.05)。

　　2.3  各组TNF、MDA、SOD的组间比较 ANIT造模后48h，造模组血清TNF(P<0.01)、MDA(P<0.05)均较正常组升高，而血清SOD活性(P<0.01)减低。 HZM治疗组与造模组相比，能显著降低血清TNF(P<0.05)、肝MDA(P<O.01)水平，增高血清SOD活性(P<0.01)。泼尼松对照组与造模组相比，亦能降低血清TNF(P<0.05)、MDA(P<0.05)水平，但对SOD活性(P>0.05)无影响。

　　2.4  直线相关分析 相关分析表明，TNF与MDA(r=0.478，P<0.05)呈正相关。

　　2.5  肝组织病理学观察 光镜下显示，造模组在造模后48h可见肝小叶结构破坏，大的分支处的汇管区及周围病变较为严重，较小的汇管区及周围病变相对较轻。汇管区炎性细胞浸润明显，肝细胞肿胀、胞浆疏松，肝细胞核大小不一，可见气球样变和颗粒样变性，及灶状坏死，肝窦内可见活化的枯否细胞。肝血窦受肿胀的肝细胞挤压明显变窄。小叶间胆管管壁结构不清，排列不规则，上皮细胞肿胀，有的胆管上皮细胞出现嗜酸性变，坏死、脱落进入管腔，致使管腔狭窄，甚至堵塞不通。汇管区胆小管增生，胆管数量增多，新生的上皮细胞有的已形成小管腔，有的尚未形成。有的胆管上皮形成双层、多层上皮，管壁变厚，管腔狭窄。 HZM治疗组较造模组肝组织受损明显减轻，肝小叶结构基本正常，汇管区炎症细胞浸润减少，小叶间胆管阻塞有所改善，胆管上皮细胞有修复迹象，肝细胞增生活跃，可见核分裂相。肝细胞肿胀减轻，未见坏死，肝窦狭窄明显缓解。泼尼松对照组汇管区炎症较造模组明显减轻，小叶间胆管阻塞明显改善，但仍可见肝细胞肿胀、变性及灶状坏死。

　　3、讨论

　　ANIT是一种间接的肝毒剂，它对肝脏的损害，主要是引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁瘀积，并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害。由于ANIT诱发的肝内胆汁瘀积模型在实验动物中重现性好，结果稳定，方法简单易掌握，而被广泛使用。TNF-ct是一种重要  的前炎性因子，适量时可发挥免疫调节功能，分泌过多或调节失控时则引起免疫病理损伤。TNF-ot与肝损伤密切相关。TNF-c~的大量释放可激活中性粒细胞并黏附至肝窦内皮细胞，产生和释放自由基，使肝细胞膜和细胞器发生脂质过氧化而损伤肝细胞。另一方面可通过灭活肝组织纤溶酶原激活物而抑制纤溶反应，通过增强组织因子表达，下调血栓调理素表达而激活凝血系统，导致毛细血管微血栓及DIC形成，引起血液流变学和动力学改变，使各脏器产生缺血性改变，并能刺激激活多型核粒细胞，使之释放多种损伤物质，如各种氧化剂、蛋白酶等，这些都是强力迫坏肝组织的物质，释放入血可造成肝脏的损害。TNF一α还能诱导IL-1、IL-6等基因的表达，活化磷脂酶A2(ALA2)，致使花生四烯酸分解，产生PAF、LT3、PGE2、TXA2等炎性介质，从而加剧肝组织损伤及微循环障碍。MDA是体内氧自由基代谢的终末产物之一，其增多意味着氧自由基的大量释放，而SOD能清除超氧  阴离子自由基，保护细胞免受损伤。ANIT造模后48h，造模组血清TNF、MDA均较正常组升高，而血清SOD活性减低。通过相关分析表明，TNF与MDA呈正相关。考虑二者之间有协同作用，共同引发肝脏的损害。而HZM能显著性降低TNF、MDA水平，提高SOD活性，提示HZM的作用机理可能与调节免疫功能，降低TNF的生成和释放，少脂质过氧化物的生成，提高机体抗氧化能力有关。

   　 本模型大鼠造模后出现身黄、目黄、小便黄，排泄器官秽浊，纳食减少，活动减少，符合中医学对于阳黄湿热黄疸的描述，各种致肝损伤的炎陛因子及介质、代谢产物的产生可概括为中医的内生毒邪，且组织学上有小叶间胆管狭窄、堵塞，肝窦瘀血表现，从微观角度体现了气滞血瘀的病机。HZM由虎杖、栀子、金樱子3味药组成。虎杖清热除湿，活血化瘀，疏肝利胆为君药；栀子清热解毒、利胆退黄，为臣药；金樱子酸甘以养肝阴，防止苦寒伤肝为佐药。其处方紧扣湿、毒、瘀的病机，施以清热解毒利湿、活血化瘀的治则，可谓证治相合。从实验结果分析，HZM的作用非局限于某一环节或某一递质，而是具有多靶点、多效应的作用特点，体现了中医用药的整体观念，亦是其较西药的优势所在。

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