地黄饮子含药脑脊液对受损PC 1 2细胞
PCI2细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞克隆化的细胞株，具有典型的神经内分泌细胞的特性，它是用于研究神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的实验材料，也是研究神经毒性的最常见的细胞株，PCI2细胞被广泛作为-种良好的神经系统体外模型，用于研究多种神经系统疾病，如AD、帕金森氏病等。现代医学认为，AD是-种以脑的退行性病变、脑细胞萎缩为其病理基础的痴呆症候群，老年斑、淀粉蛋白(B— AP)沉积及神经纤维缠结(NFT)是其脑部主要的病理学特征。β-淀粉样蛋白(Ap)在脑组织及血管周围异常沉积形成老年斑，是AD的-个重要的病理学特征，邮是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成与发展的关键因素。实验发现，多数细胞与Ap接触后表现出核内染色质浓缩、DNA断裂等细胞凋亡典型的形态与生化特征，Aβ通过凋亡途径导致细胞死亡。“老化”的AB呈聚集状态，其毒性增强，故本实验采用“老化”状态的Aβ。
1、 实验材料
1.1实验动物
大耳自家兔，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2实验药物
地黄饮子药物组成：熟地黄、山茱萸、肉苁蓉、巴戟天、石菖蒲、茯苓、远志、肉桂、石斛、麦门冬、五味子、炮附子各20g，薄荷、生姜、大枣各5g。加10倍水浸泡2h，煎煮1h后，倒出药液，再加等量水煎煮1h，将2次所得的药液混合，浓缩成200％的混悬液，配制成含生药2g·ml-1地黄饮子浓缩液，4℃保存备用。阳性对照药：维生素E。
1.3实验主要试剂
AB25埘(Sigma公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；青霉素／链霉素(Sigma公司)；高糖DMEM培养基(Hy- clon公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；D—Hanks缓冲液(Hyclon公司)；氯化钙(郑州化学试剂-厂批号：990506)；Flou-3／AM(Molecular Probe Inc)。
1.4实验仪器
LSM510(德国蔡司公司)；96孔培养板(OrangeScientific)；二氧化碳培养箱TC 2323D(中国广州南方生化医学部)。
2、 方法
2.1细胞培养和预处理
PCI2细胞购于中科院上海细胞库。DMEM培养基中含有10％的胎牛血清、1％青毒素／链霉素抗生素。于37~C、5％C02饱和湿度培养箱中培养。2d更换1次培养液，待细胞进入对数生长期时，用O.05％的胰蛋白酶消化细胞，1：3—1：4分瓶传代，选取对数生长期细胞做实验。
2.2中药脑脊液的提取方法
体重为2kg大耳自家兔，适应性喂养3d，灌胃给予地黄饮子水煎剂(含生药比为2：1)，维生素E溶液，灌服药量按成人量10倍给药，空白组给服等体积的蒸馏水。以上步骤连续3d，于末次灌胃后1h立即给予戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200~1脑脊液，并补充等量生理盐水，把3d获得的同-家兔的脑脊液混合，-70％冻存备用。
2.3实验分组
实验分为空白组，模型组，西药对照组，地黄饮子低、中、高剂量组六组。
2.4药物制备
Flou-3／AM荧光探针加DMSO稀释至1mmol·L-1的储备液，实验时用D—hank液稀释成5μmol·L-1的工作液(所有配制过程均在避光条件下进行)，精密称取氯化钙加蒸馏水稀释至1 mol·L-1的工作液。
2.5细胞培养和Flou-3的负载
取培养瓶中处于对数生长期的PCI2细胞，消化后，加入-定体积含10％FBS的DMEM完全培养液，将细胞密度调至1×104个·ml-1，每孔1001xl接种于96孔细胞培养板上，在37℃、5％C02的细胞恒温培养箱中培养，观察细胞贴壁后，空白组和模型组加空白脑脊液10％，西医对照组加含维生素E的脑脊液10％，地黄饮子低、中、高剂量组分别加含地黄饮子脑脊液5％、10％、20％，各组加入脑脊液后继续培养2h后，弃培养液，用D—hanks液洗涤3次后，于避光条件下加入100μL Flou-3。在细胞培养箱中负载50min，弃去 Flou-3，用D—hanks再洗涤3次，洗去细胞外残余染料。各组加人lOOμL无血清培养液，待测。
2.6加药及扫描
检测条件设定为：激发波长为488nm，发射波长为525nm，采样频率488HZ。加氯化钙观察细胞活性。细胞置于激光共聚焦显微镜下每隔10S进行扫描，开始连续扫描2次后各组加入药物，空白组加D—hanks液，其他组加入Aβ25-35，动态观察各组细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i的变化，共扫描30次。以上操作重复6次。计算机记录储存扫描结果。
2.7数据分析
计算出细胞的平均荧光强度，每次扫描选取6～8个细胞，画出荧光强度随时间变化的曲线，即荧光强度变化值。
3、 结果
Flou-3／AM孵育PC12细胞后均能着染细胞。静息状态及加药后达到峰值时的平均荧光强度变化值，结果见表1。
表1 平均荧光强度变化(x±s)
组别 n 静息状态 加药后达到峰值
空白组 6 53.567±6.6578 47.53±9.95**
模型组 6 49.800±6.0847 109.60±12.85
西对组 6 38.467±5.1794** 90.45±
中低组 6 37.683±5.1429** 82.77±12.66**
中中组 6 32.900±3.9714** 76.35±6.45**△
中高组 6 32.117±4.8056**△ 72.08±6.64**△△
注：与模型组比较，**P<O.01，*P<0.05；与西对组比较，△△P<0.01，△ P<O.05。
结果显示，各组在没有加入药物之前，荧光强度处于静息状态，空白组与模型组之间没有差别(P>0.05)，各含脑脊液组荧光强度与空白组比较，荧光强度降低，差异显著，有统计学意义(P<0.01)，且静息状态时与西对组比较，中中组、中高组荧光强度降低，差异具有显著性(p<0.05或P<0.01)；空白组加入D—hanks液后细胞变化不明显，加药前后没有差异(P>0.05)。各组加入Aβ25-35后PCI2细胞胞内平均荧光强度明显上升，模型组荧光强度与空白组比较升高，差异有统计学意义(P<0.01)。含有脑脊液各组加入 Aβ25-35后虽然荧光强度升高，但荧光强度达到峰值的平均强度与模型组比较明显降低，差异有统计学意义(P<O.01)，而且中高组与西对组比较，荧光强度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。地黄饮子脑脊液可以降低AB引起的钙离子内流。
4、 讨论
激光扫描共聚焦显微镜结合Fluo-3／AM的应用，探针Fluo-3／AM是Fluo-3的乙酰甲基酯化形式，穿越细胞膜进人细胞内，再被活细胞内的非特异酯酶水解，与细胞内游离钙呈高度结合显示荧光，其荧光强度与所结合的Fluo-3／AM细胞内游离钙离子浓度成正比，所以测得的荧光强度可作为反映细胞内游离钙离子浓度的指标。
钙离子是细胞内重要的第二信使，本实验所采用的荧光染料Fluo-3／AM为单-激发波长488nm的荧光染料，与细胞内游离钙结合，525nm处荧光强度明显加强，达基础值的40倍，与其他的荧光染料相比，更利于钙离子浓度的测定，细胞浆Ca2+源于细胞外ca“内流和细胞内Ca2+库的释放，细胞外Ca2+主要通过ca2+道进入细胞，而细胞内ca2+主要通过质膜钙泵、Na+／ca2+交换释放出细胞外。此外，肌浆网上钙泵对钙的摄取也参与了细胞内ca2+浓度调节。关于钙波动，大多不依赖细胞外钙的存在，是由于细胞内储存Ca2+的周期性释放造成，也有少数依赖细胞外钙，由于钙流入与流出之间平衡的周期性改变引起。正常情况下，细胞内游离钙之所以保持低浓度，主要是由于细胞膜上Caz+-ATP酶作用的结果，而细胞内钙库的调节作用，对于钙离子正确传导细胞内外信息至关重要。
为了进-步探讨地黄饮子对神经细胞保护作用的机制，我们用激光共聚焦显微镜技术检测了地黄饮子脑脊液对Aβ诱导的胞内钙离子浓度增加的影响，经 fluo-3染色后的细胞成红色荧光，PCI2细胞在静息状态下荧光强度较为稳定，没有钙离子的振荡。加入 Aβ25-35后，细胞内钙离子浓度迅速增高，并且较快恢复。水溶性Aβ25-35作用早期可以破坏神经细胞的钙离子稳态，使细胞对外界生理性或病理性刺激敏感度增强，容易遭受损伤。分析结果表明，101xmol·L-1 Aβ可使PCI2细胞内钙离子浓度明显升高，说明促进胞内钙离子浓度升高是Aβ发挥细胞毒性作用的-个重要途径。
地黄饮子出自刘河间的《素问宣明论方》，主治喑痱，肾气虚弱厥逆，语声不出，足废不用。现代医家运用地黄饮子治疗以肾虚为主的多种疾病。根据老年性痴呆肾虚痰凝的病机，我们已对应用地黄饮子治疗老年性痴呆做了相关实验研究。细胞内游离钙离子的浓度升高是细胞凋亡、神经细胞衰老的关键环节之-，钙拮抗剂可有效地阻断细胞外钙离子的内流，有助于细胞内钙的稳定，延缓神经元的死亡，减慢疾病的进展。各种原因造成的细胞内钙超载、钙稳态失衡是造成细胞死亡的最后总通路，衰老时出现的生理和病理形态变化与海马神经元内钙离子浓度稳定性改变有关。
实验结果表明：地黄饮子可以通过脑脊液，含药脑脊液对Aβ导致的PCI2细胞损伤具有明确的保护作用。地黄饮子脑脊液可以明显减轻Aβ25-35诱导的胞内钙离子浓度的升高，维持胞内钙离子稳态平衡，这可能是地黄饮子脑脊液具有细胞保护作用的重要机制之-。
本实验建立了PCI2细胞系Aβ细胞损伤的AD模型，证实了Aβ25-35的损伤机制与诱导细胞内钙离子浓度增加和导致细胞凋亡有关。并发现地黄饮子脑脊液具有明确的细胞保护作用，其机制可能与拮抗Aβ25-35诱导的细胞内钙离子增加和细胞凋亡有关。
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