中药复方肺积散对肺癌小鼠Fas／FasL蛋白表达影响的实验研究

　　本研究采用小鼠移植性Lewis肺癌模型，进行中药复方肺积散免疫抑制作用的实验研究，为研制理想的可供临床应用的抑制剂提供实验依据。

　　1、 材料与方法

　　1.1动物近交系C57小鼠40只，雄性，6周龄，体重19-22g，由哈尔滨医科大学肿瘤医院动物实验中心提供。

　　1.2瘤株Lewis肺癌瘤株，由长春生物试剂动物实验中心提供。

　　1.3药物复方肺积散：太子参、黄芪、牡丹皮、莪术、白花蛇舌草、山慈菇、茯苓、麦门冬、天花粉、地骨皮、天门冬、甘草等十二味中药组成，由天江医药公司提纯制作，经沸水冲泡，每O.2ml含药量相当于60g·kg-1。

　　1.4主要试剂和仪器设备  医用超净工作台SW— GIF：中国苏州净化设备厂；超低温冰箱MDF一328：日本三洋公司；高速冷冻离心机：1t21日本日立制作所；透射电子显微镜：H一600日本日立公司；电子分析天平：AB一204一N梅特勒托利多有限公司。

　　1.5 Lewis肺癌动物模型的建立液氮冻存的小鼠 Lewis肺癌细胞复苏后，先接种于3只小鼠右腋窝下传代；处死小鼠，按无菌操作程序，lOd后，脱颈处死Lew- is肺癌小鼠，放人75％酒精浸泡消毒lOmin，在超净工作台上分离瘤体，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水洗净后剪碎，再加生理盐水研磨，过300目尼龙网制成单细胞悬液，台盼蓝(tryan—blue)染色试验计算后细胞数>95％，调整瘤细胞悬液浓度为1×107个·ml-1。瘤细胞。选lewis小鼠，体重18～22g，于每只小鼠右侧腋窝皮下接种肺癌瘤细胞悬液O.2ml。

　　1.6分组及给药随机分组lewis小鼠在瘤株接种后 l周，成瘤后随即分组；肿瘤对照组10只，每日用O.2 ml-1生理盐水灌胃，连续18d；化疗组10只，顺铂(DDP)20mg／瓶，以生理盐水稀释成O.2rag·ml-1，以0.3ml-1·20g。体重每日腹腔注射1次，连续18d；中药组10只，隔日1次喂饲中药0.2ml-1／只，共给药18d；中药加化疗组10只，隔日1次喂饲中药O.2ml／只，并给予顺铂以无菌生理盐水稀释成O.2mg·ml-1，每只0.3ml·20g-1，腹腔注射，每日1次，共给药18d。

　1.7  观察指标与测定方法将lewis肺癌小鼠肺癌组织加入适量生理盐水捣碎，离心lOmin，取上清液，将所有试剂充分混匀，加入稀释后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内；立即加入50ul的生物素标记的抗体；盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1h；甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干；重复此操作3次；每孔加人80ul的亲和链酶素一HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30rain；甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干；每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37％温育10rain，避免光照；取出酶标板，迅速加人50ul终止液，加入终止液后立即测定结果；凡细胞浆和／或细胞膜显示棕黄色颗粒者为Fas、 FasL蛋白染色阳性。每张切片在400倍光镜下顺序找10个视野，计数细胞总数和Fas、FasL蛋白阳性表达细胞数，计算出每张切片上Fas、FasL蛋白阳性表达的百分数。

　　1.8统计学处理数据处理实验结果以均数±标准差表示。样本均数的比较用方差分析。数据采用 SPSS 10.0统计学软件进行处理。   

　　2  结果  见表l。

      表1  复方肺积散对Fas、FasL蛋白表达与肺癌

            小鼠病理特点的关系(x(_)±s)

肿瘤对照组      　 10／8           56.49±10.72      　 65.89±17.02

    化疗组        　 10／10          60.08±11.39     　  60.46±15.87^#

　　注：与对照组比较，#P<O.05。

 　　3、讨论

   　 Fas(CD95受体)及FasL(CD95配体)属肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员、为一类跨膜蛋白。Fas与 FasL及相关调控因子组成Fas系统，在传递细胞凋亡信号、发挥免疫监控中起重要作用。有些肿瘤是正常的细胞凋亡丧失所致，而非细胞过度增殖所为。最近的研究表明：Fas／FasL途径调控失常，引起细胞凋亡抑制，在肿瘤细胞逃避机体免疫监控中起重要作用。在有些类型的肿瘤细胞中，Fas表达下调，而FasL表达上调。当肿瘤细胞Fas水平下调至低于Fas／FasL途径诱导凋亡的阈值时，肿瘤细胞凋亡受到抑制，而肿瘤细胞表面FasL表达使Fas高表达，激活T淋巴细胞发生凋亡，从而导致肿瘤细胞凋亡途径发生改变，逃避机体免疫监控。

    　中医学认为，“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”。中药复方肺积散的主要功效是益气养阴、活血消癥。地骨皮具有凉血除蒸、清肺降火之功，现代药理研究地骨皮还具有抗肿瘤的作用，其有效成分p一谷甾醇对小鼠腺癌、Lewis肺癌和大鼠瓦克癌瘤具有活性；太子参、黄芪等补气生津健脾药物可调节肿瘤患者免疫机能；白花蛇舌草、天花粉、牡丹皮等清热凉血解毒药有直接或间接抑制肿瘤细胞的作用，具有较强的抗癌活性；莪术等活血化瘀药可减弱血小板凝聚性，使癌细胞不易在血液中停留、聚集、终止，并具有直接杀灭作用。

　　本研究表明，中药复方肺积散可影响荷瘤小鼠 Fas／FasL蛋白的表达，与顺铂合用可加强抗Lewis肺癌的作用。复方肺积散具有不同作用成分，增强人体免疫力，为临床提供安全有效的免疫抑制剂。

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