半枝莲联合反应停治疗肝癌的实验研究
动物可移植性肿瘤是目前国内外肿瘤实验研究中最常用的一种模型。小鼠移植性肝癌模型H22作为对药物进行临床验证的“筛选系统”已证明是有效的。本实验将半枝莲与反应停联合应用，通过建立BALB／c小鼠皮下接种肝癌H22细胞建立移植癌模型来探讨其抑瘤效果；采用抗cD3l单抗做免疫组化染色，测定移植瘤组织微血管密度(MvD)，探讨半枝莲和反应停联合用药的抗肿瘤血管生成作用。
1材料与方法
1．1细胞培养
H22细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640(GIBCO公司)培养液中，置于c02浓度为5％、相对湿度为95％、温度为37℃的细胞培养箱中培养。细胞传代后培养48、96 h的贴壁细胞为对数生长期细胞，取传代后48 h细胞。
1．2半枝莲乙醇提取液的制备
用半枝莲干品50 g，采用4倍量的70％乙醇加热回流提取3次，每次1 h。120目网筛过滤弃药渣，用干燥滤器过滤，取滤液25 mL，用旋转蒸发仪蒸干后，105℃干燥3 h，冷却30 min，-称取干燥品重量，所得重量／25 mL即为半枝莲乙醇提取液。将剩余滤液调整pH值至7．O～7．2后于20℃保存备用。
1．3造模
采用BALB／c小鼠，5周龄左右，雄性，体重(17-4-2．19)g。记录接种前每只小鼠体重。接种对数生长期H22细胞于小鼠右侧腹股沟皮下，接种量约6．O×106／只。28只BALB／c小鼠接种后完全随机分为4组，每组7只。反应停组(A组)自接种第1日起，反应停50 mg／kg灌胃Dl-12：半枝莲乙醇提取液瘤内注射组(B组)半枝莲乙醇提取液l g／mE O．2～O．5 mL瘤内注射D6，8。 lO，12；联合用药组(c组)同时采用A组与B组的给药方法；对照组(D组)自接种第6日起，1％乙醇0．2～0．5 mL瘤内注射 D6，8，10，12。自接种第4日起每日测量小鼠右侧腹股沟皮下移植瘤大小。瘤体体积=，r／4Xa×b2(a为长径'b为短径)。接种第12日，小鼠称重后脱颈髓处死荷瘤小鼠，剥离瘤体后称取瘤重。抑瘤率=(对照组瘤重一给药组瘤重)／对照组瘤重×100％；协同系数=对照组瘤重×联合用药组瘤重／(单药组①瘤重×单药组②瘤重)；当抑瘤率>40％，P<O．05判定有抗肿瘤作用；当协同系数<l时为有协同性。
1．4免疫组化测定瘤体血管密度
移植瘤采用抗CD31单抗做免疫组化染色，测定移植瘤组织MVD。参照文献[2]方法，在低倍镜下选取5个MVD最高的区域，lOX25倍放大的视野下，每一个着染的单个内皮细胞或细胞串计为1个微血管，血细胞和大的血管腔不计。
1．5统计学方法
所有数据均用x±s表示，采用Microsoft excel软件对数据做统计学处理，采用方差分析。
2结果、
3讨论
Caspases是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase)的简称，在细胞凋亡的信号通路中，Caspase-3，7是处于核心地位的效应分子，其酶原能够被Caspase一8和Caspase-9激活，最终导致细胞凋亡。2006年，Judy Yuet-Wa Chan等研究发现，半枝莲中分离的脱镁叶绿甲酯酸(pheophorbidea，C3sHzsN40s)可通过抑制Bcl-2基因，DNA断裂，阻滞细胞周期，释放细胞色素c进入胞质和激活 Caspases-3、Caspases-9等机制诱导肝癌Hep3B凋亡。本实验采用半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合反应停治疗H22移植瘤，联合用药组瘤重明显小于对照组(P<O．01)。其具体的抗肿瘤作用机制值得进一步探讨。
血管形成是肿瘤生长、转移、复发的关键环节，是瘤细胞诱导毛细血管形成而建立血液循环的过程。D'Amato等进行家兔角膜微袋分析研究后，发现反应停能抑制由bFGF诱导的血管生成。Kenyon等在小鼠试验中证实，反应停能有效抑制由bFGF和VEGF诱导的角膜血管生成。适量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)是机体免疫防护的重要介质，而过量的TNF～α可影响宿主的免疫状态，造成体重下降、恶液质、免疫应答改变和贫血等。在许多恶性肿瘤中，TNF—α表达过高。在反应停生物活性中，最确切的就是其对很多恶性肿瘤中过多表达的TNF-a的抑制作用。Rowland等通过RT—PCR研究证实了反应停诱导 TNF-α的mRNA的降解从而选择性的抑制了TNF-α的表达。
本研究采用小剂量反应停(50 mg／kg)联合半枝莲乙醇提取液瘤内注射治疗小鼠移植瘤，观察到反应停组和半枝莲乙醇提取液组均有抗肿瘤血管生成作用，且两药联合有协同作用。虽然反应停组瘤重小于对照组，差异无统计学意义，但是反应停和半枝莲联合用药对B22移植瘤有显著的抑制作用，其具体机制值得进一步研究。BALB／c小鼠肝癌移植模型周期较短，肿瘤的大小和位置较易控制，与人肝癌有所不同。因此，已在移植瘤模型上取得的初步结果是否与人体一致还需进一步验证。
(如果您认为转载内容侵犯了您的权益，请及时联系我们，本网站将在收到信息核实后24小时内删除相关内容。)
