青蒿素及其衍生物抗肿瘤作用的研究现状
青蒿素(artemisinin)是我国从传统中药黄花蒿中分离得到的高效、低毒的抗疟药物，其后合成了很多衍生物，如蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素等。近年来发现青蒿素及其衍生物具有较强的抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞具有抑制、杀伤作用。药理学研究证实，青蒿素及其衍生物除抗疟、抗肿瘤外，还有抑制白细胞增殖效应。现就近年来国内外学者对青蒿素及其衍生物有关抗肿瘤的研究综述如下。
l概述
青蒿素是一种含有过氧基团的蓓半内酯化合物，为无色针状晶体，熔点156～158℃，旋光度[α]17D+66．3(C=1．644氯仿)，高分辨质谱m／e288．1472(M+)及元素分析(C66．72％、 H7．26％)显示其分子式为C15H2205。青蒿素有多种衍生物，包括蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素等。目前研究较多的是青蒿素、二氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯和蒿乙醚等。
2青蒿素及其衍生物的抗肿瘤机制
2．1细胞毒作用及氧化应激直接杀伤肿瘤细胞：青蒿素类药物分子内多含有过氧化桥结构，这种结构与亚铁原子起反应后断裂可产生以碳为核心的自由基或亲电子中间产物，攻击细胞膜及细胞内其他膜性结构，或直接氧化应激造成蛋白质分子损伤，导致细胞死亡。铁的存在是发挥细胞毒作用的必要条件，此即抗肿瘤的主要机制。研究发现，与正常细胞相比，癌细胞核酸代谢旺盛，需要大量铁质，多数肿瘤细胞表面有高密度的转铁蛋白受体，而正常细胞转铁蛋白受体较少。因此，Singh提出青蒿素类通过过氧基团与癌细胞内的铁作用，分解产生自由基，对肿瘤细胞自身亦有特异性杀伤作用。将乳腺癌细胞与整铁蛋白一起培养，使癌细胞内铁离子浓度增加，再加入双氢青蒿素。结果，双氢青蒿素能有效杀伤一类对放射线不敏感的乳腺癌细胞，而对正常乳腺细胞影响很小。近来，Lai等研究表明，用与转铁蛋白结合的青蒿素混和物处理人白血病Molt4细胞，可以有效、有选择地杀灭肿瘤细胞，且对正常细胞几乎无毒性。2．2诱导肿瘤细胞凋亡：研究表明，细胞凋亡对肿瘤起负调控作用，肿瘤的发生发展不仅缘于细胞增殖速度过快，而且与细胞死亡速率下降有关。通过对青蒿素及其衍生物近年来的研究发现，诱导细胞凋亡目前主要有4种方式：①调节肿瘤相关基因的表达诱导凋亡：在肿瘤细胞凋亡途径中，p53是重要的抑癌基因，其生物学功能是在G1期监视细胞基因组DNA的完整性。如果DNA受损伤，p53蛋白就使细胞停留在G1期，修复后再进入M期；如果不能修复，则诱导其凋亡。但p53并非凋亡发生必不可少的调控基因。根据p53在凋亡中的作用，细胞凋亡信号途径可分为p53基因依赖、非依赖两种途径。曹智刚通过RT-PCR实验，证实双氢青蒿素可使A549细胞的 bcl-2mRNA表达减少、baxmRNA表达增加。bcl-2、bax属于由 p53基因调控的bcl-2基因家族，因此认为双氢青蒿素诱导肿瘤细胞凋亡是通过p53基因依赖途径。吴理茂等观察到青蒿琥酯作用后，bcl22蛋白阳性SMMC27721肝癌细胞减少的同时， bax蛋白阳性细胞数增多，DNA拓扑异构酶活性增强。但杨小平等认为，青蒿琥酯诱导肝癌BEL27402细胞凋亡的分子机制为非P53基因依赖途径，产生这一差异的原因还有待于进一步探讨。②线粒体膜电位下降诱导细胞凋亡：在青蒿素对K562凋亡的研究实验中，检测到青蒿素能抑制内向整流钾电流，使细胞线粒体跨膜电位下降，且这些改变发生在凋亡细胞的形态学改变之前，提示跨膜电位为凋亡早期阶段。聂蕾研究了青蒿琥酯诱导人早幼粒白血病细胞HL60凋亡的线粒体机制为线粒体膜电位下降、Caspase酶活性增加，故认为青蒿琥酯通过线粒体途径诱导细胞凋亡。③端粒酶活性下降诱导凋亡：端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白多聚酶，其活化可弥补复制造成的端粒缩短。端粒酶活性的增强与肿瘤的发生发展密切相关。青蒿素能抑制K562细胞生长，并在细胞生长和凋亡发生过程中伴随着细胞端粒酶活性的显著下降，刘加军的研究结果表明，随着青蒿素对K562细胞作用浓度的上升和作用时间的延长，端粒酶活性逐渐下降并呈量效关系，其中6 mmol／L的青蒿素引起的端粒酶活性下降最为明显，作用72 h后细胞端粒酶活性最低。④肿瘤细胞内钙升高导致细胞凋亡和胀亡：周晋在研究青蒿素对人白血病细胞株和原代细胞的影响中，通过激光共聚焦显微镜发现，青蒿素作用于白血病细胞膜可使其通透性改变、细胞内钙升高，一方面促凋亡物质释放、caspase激活、细胞凋亡：另一方面激活钙蛋白酶(calpain)，导致胀亡发生。2．3抑制肿瘤细胞的增殖：青蒿素的抗肿瘤作用可能与细胞周期某一特殊靶蛋白结合，调控细胞周期的结果。Efferth等研究青蒿琥酯对肿瘤细胞的影响，与对照组比较，不同浓度药物组可影响细胞倍整时间(尸=0．00132)，且将肿瘤细胞阻滞-在G0 l-G1期，S期细胞显著减少(P=0．02244)。Li等发现，青蒿素衍生物对P388细胞的抗增殖效应是将细胞阻滞于G。并诱导其调亡的结果。Wu等在研究其他青蒿素衍生物的细胞毒活性时，亦证实能将L1210及P388细胞阻滞于细胞周期中的Gl期并导致细胞调亡。亦有研究显示不同结果，周晋等研究青蒿素对人白血病细胞株NB4、K562和原代APL细胞的影响及可能机制，结果显示，青蒿素明显抑制NB4、K562和 APL细胞增殖，将细胞周期阻滞于G2+M期。又据报道，青蒿琥酯作用于HL60细胞48 h后，G2+M期细胞增多、S期细胞减少，提示细胞发生G2+M期阻滞，DNA合成减少，同时~SIEGi期细胞增多，凋亡率增高。细胞周期与肿瘤的关系是近年来抗肿瘤研究的热门课题，研究发现，细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关。青蒿素及其衍生物能抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞于G0+GI或G2+M期，肿瘤细胞不同，被阻滞的周期也不同。2．4 抑制肿瘤血管生成：肿瘤的生长与转移依赖血管生成建立的丰富血液循环，以供应肿瘤组织异常旺盛的生化代谢及瘤细胞的繁殖与转移。研究表明，青蒿素衍生物对肿瘤血管生成的抑制作用，主要与抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和分化有关。陈欢欢在研究青蒿琥酯对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长、迁移及小管形成实验中发现，青蒿琥酯对此3个环节均有较强的抑制作用，提示青蒿琥酯在体外有抗血管生成作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种与血管形成及功能密切相关的因子，通过与内皮细胞表面VEGF受体(Flt21和KDR)特异性结合，促进内皮细胞增殖、迁移，并形成新生血管。李菌等发现，双氢青蒿素能有效抑制高表达VGEF的K562细胞增殖，在较低浓度(2~rnol／L)时即能显著抑制K562细胞VGEF蛋白和mRNA的表达。在对K562细胞培养基促血管新生作用的研究中发现，经双氢青蒿素处理后，K562细胞培养基的促内皮细胞增殖能力明显减弱，在血管新生研究模型中的促血管新生作用亦有所下降。另研究显示，青蒿素可抑制淋巴管生成，其机制与抗血管生成作用相类似，这对抑制肿瘤转移，提高存活率具有重要意义。2．5 免疫调节作用：肿瘤细胞可通过分泌免疫抑制物质，如转化生长因子(TGF-B1)、VEGF、白细胞介素(IL-4、IL-6、IL一10)等，使肿瘤局部形成深度免疫抑制，导致免疫细胞无力清除有效攻击。崔溦等研究青蒿琥酯可否逆转Colon26肿瘤细胞对免疫细胞功能的抑制，结果发现，不经青蒿琥酯作用的 Colon 26培养上清中5种免疫抑制物质均可被测到，以TGF-B1含量最高；该上清对所测小鼠脾细胞免疫功能均有显著抑制作用。青蒿琥酯作用后的Colon26，第1次培养上清ff'JTGF-B1、VEGF、 IL-10含量，及对小鼠脾细胞ConA诱导转化、CD4+CD8一表达及N K细胞杀伤的抑制均明显降低；第2次培养上清的TGF-131、 IL一10含量，及对ConA诱导转化和CD4+CD8一表达的抑制继续保持较低，VEGF含量及NK细胞杀伤的抑制恢复至对照水平。分析显示，青蒿琥酯作用后，Colon26培养上清对小鼠脾细脆转化的抑制均与TGF-Bl含量正相关；对NK细胞杀伤的抑制与几-10含量正相关。以上结果表明，青蒿琥酯可通过抑制免疫抑制物质的分泌而逆转Colon26肿瘤细胞的免疫抑制作用。
3青蒿素及其衍生物抗肿瘤的作用特点
3．1对肿瘤细胞杀伤具有选择性：2001年，有学者将乳腺癌细胞与转铁蛋白共同培养，待细胞内Fe2+浓度增加后，加入二氢青蒿素，则可有效杀伤对放射线不敏感的乳腺癌细胞，暴露在转铁蛋白和二氢青蒿素下的癌细胞在16 h内全部死亡，小部分正常乳腺细胞被杀死。青蒿素类药物的这种选择性，与Fe2+具有相关性。Kim等发现，双氢青蒿素可对神经胶质瘤U373MG细胞产生辐射致敏作用，当双氢青蒿素与转铁蛋白共同作用后，致敏作用显著增强。Lai等[21 J将青蒿素与转铁蛋白共价结合，使青蒿素抗肿瘤作用以及对肿瘤细胞的选择性明显提高。Efferth等对星形细胞瘤U373细胞、人类淋巴细胞性白血病CCRF-CEM细胞的研究也表明，转铁蛋白、 Fe。’氨基乙酸硫酸亚铁能提高青蒿素类药物的细胞毒作用，而对正常细胞影响较小。3．2逆转肿瘤的多重耐药性：青蒿素及其衍生物治疗疟疾的优点在于与其他抗疟药间无交叉耐药。研究表明，青蒿素与传统的抗肿瘤药物作用机制不同，不存在交叉耐药，且可逆转肿瘤细胞的多重耐药。Efferth通过微阵列分析多重耐药相关基因ABCBl(MDRl、P2糖蛋白)的mRNA表达，发现与青蒿素对肿瘤细胞的IC50之间无明显关系。用传统抗肿瘤药紫杉醇等作为对照研究，结果，对肿瘤细胞的IC50值、P2糖蛋白与MDRl mRNA表达均有关。并进一步研究证实青蒿素对高度表达MDRl和P2糖蛋白等耐药基因的细胞株均有抑制作用。上结果提示，青蒿素与传统抗肿瘤药之间无交叉耐药。陈卫强等通过观察双氢青蒿素和顺铂在体外对人肺腺癌 A549／CDDP细胞的作用发现，双氢青蒿素作用组、顺铂对照组的IC50值分别为1．30 lag／nil、5．58 lag／ml，两组比较有显著性差异，逆转倍数为4．29。双氢青蒿素作用组、对照组对 A549／CDDP细胞的凋亡率分别为17．6％和1．6％，两组比较差异显著(P<0．01)。双氢青蒿素作用于A549／CDDP细胞后，Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达上升。说明A549／CDDP细胞耐药作用与凋亡耐受有关，双氢青蒿素可使A549／CDDP细胞恢复对顺铂的敏感性，通过解除凋亡抑制逆转耐药。
4展望
肿瘤的传统化疗、放疗对正常细胞有较大损伤，限制了大剂量应用。研究表明，青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制，选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞作用轻微，与传统化疗药物不存在交叉耐药，且通过抑制谷胱甘肽转移酶的活性而逆转肿瘤细胞的多药耐药，与传统化疗药同时应用可起到协同、增效作用。鉴于青蒿素及其衍生物的确切抗癌作用，美国国家癌症研究所已把其纳入抗癌药与抗癌活性研究计划。青蒿素类药物与传统化疗药相比具有来源广泛、廉价、抗癌谱广、毒副作用小等特点，其化学结构独特，室温长期贮存无显著降解，口服青蒿素安全、有效、符合青蒿素体内代谢特点。因此，青蒿素作为一种新型抗肿瘤药具有广阔的应用前景。目前虽对青蒿素及其衍生物抗肿瘤机制研究很多，但青蒿素及其衍生物作为抗肿瘤药还有很多问题需要解决。
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