中药及其复方血清药理学研究的方法学分析与评价

　　血清药理学是指用含有药物成分的血清施加于体外实验反应体系的一种半体内实验方法，是一种间接添加法，不仅可排除中药粗制剂中杂质、电解质等的干扰，且能反映药物在体内的生物转化过程及作用机制，具有创新性。本文结合近几年文献报道，就血清药理学方法的研究背景、方法学规范化探讨、综合评价(优势、问题)、展望做一综述。

1    中药血清药理学的研究背景

        长期以来，中药体外药理学实验普遍采用将中药粗制剂直接加入体外培养体系或反应体系中，观察其效应，最后把各种成分的效应相加，说明某一中药或复方功效的方法。这种直接添加法在方法学上存在一些问题和缺陷：①中药大多数情况下是口服给药，经过胃肠道、肝脏代谢后，进入血液的有效成分并不完全是原药成分，还包括中药在体内的代谢物、机体反应物、生物活化物等多种成分。血液中的有效成分并非完全原药成分，可引起假阴性结果；若为非吸收物质的体外作用，则易出现假阳性结果；②中药由多种成分组成，这种多成分的整体效应并不等于各部分效应之和；③中药本身的理化性质不十分恒定，对离体实验产生干扰，体外实验结果可能影响药效的判断和评价；④直接添加无法体现中医以“辨证论治”为核心的理论体系。

　　综上所述，中药粗提物的体外药理实验结果，难以反映体内真实血药浓度下的药理作用及变化规律，亦不利于中药制剂药理作用的机理研究以及合理解释其药理作用的物质基础。随着中药复方药理研究的逐步深入，要求将研究水平提高到细胞、亚细胞甚至分子水平，不少科研需要在离体实验中进行。离体试验的开展，使中药复方的研究必须借助载体。因此，1984年Hirok01wama在日本召开的第一届和汉医药学会上，提出给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的新药理学方法。1988年日本国立京都医院的田代真一提出中药“血清药理学”这一概念，指出含有多种已知和未知成分的中药复方(包括生药)口服后，经消化液和肠内菌群的代谢，形成复杂的混合物，或直接排泄、或被选择性吸收、或再经肝酶作用，进入血液的是含有真正有效成分的“粗提物”(其中包括方药的固有成分及代谢产物，以及在吸收时直接作用而产生的生理活性物质)；将含有“粗提物”的血清进行药效评价，即为“血清药理学”。1990年，姜廷良在全国中医方剂研究讨论会上，介绍了日本有关中药血清药理学研究的动态和情况后，国内陆续开展了这方面的研究。

2    中药血清药理学的方法学探讨

        血清药理学方法的规范化研究关键是中药血清制备方案的规范化研究，包括供体(实验动物)的选择、给药方案(给药剂量、次数、天数)、含药血清采集时间，含药血清低温保存及灭活处理的影响，含药血清的去蛋白处理。2．1实验动物的选择：常用实验动物为小鼠、大鼠，也可用兔、豚鼠等。罗焕敏认为，尽可能选用细胞来源相同种属的动物，但只采用同种属的动物血清将极大限制实验范围。动物类型多用正常动物，复方的药物本身及机体所产生的变化可能不完全相同，而临床服药对象多为病理状态的患者，因此病理状态下药物血清的作用尚需进一步探讨。陆慧晶认为，选择动物时应尽量选用与人类生物特性近似的物种，制备血清的动物应与获取离体器官、组织、细胞的动物一致，从而缩小或避免动物血清之间、动物血清和人血清之间在理化、生物等特性上的差异，减少因种属差异造成的免疫反应，提高实验结果的可靠性。

　　实验一般采用成年大鼠(体重为250～300 g)，并将数只大鼠的血清混合，这样既能适应实验的需要，也减少了动物的个体差异。2．2给药方案：①给药剂量：在进行血清药理学实验前，必须确定合适的给药剂量。王力倩等在研究苦参、仙鹤草的抗癌作用时发现，以参考公式(给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度)计算给药剂量，得到的含药血清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用，而比此给药量少1倍含药的血清则无明显作用。李仪奎提出增大给药剂量、血清冻干粉法两种方法。笔者认为，采取什么剂量，最好通过预试验解决，如能通过上述公式达到较好的阳性结果，则应首先采用：反之，可继续增大给药量，只要动物不死亡；如仍无阳性结果，可采用血清冻干法。②给药次数与间隔：有7～10d法(1次，d，连用7～10d)，3次给药法(连续给药3次，第l、2次间隔2h；第2、3次间隔4h)，2次给药法(第1次给药后2 h，再以相同剂量重复1次)等。无论哪种给药方式都是为了达到稳态血药浓度，便于药物作用机理的研究。究竟采取什么方案，要视药物的T1／2等药动学指标而定，最好是每隔1个半衰期给药1次，连续给4～6次，即可达到最大血药浓度，连续5～7个半衰期可达到稳态血药浓度，但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，所以7～10 d的给药方案比较保险。如果对药物血清时效关系进行研究，则另当别论。2．3含药血清的采集：目前对采血时间尚无成熟的方法，理想的采血时间应在血药浓度的高峰期。因为动物给药后，不同药物的浓度达到峰值的时间不同，且同一药物的不同指标有不同的最佳采血时间。因此，规定统一的最佳采血时间很难。文献记载96个药物的达到峰值时间：<l h的42个、1～2 h的46个、>2 h的8个，选择在给药后1～2 h采血是相对合理的。但同时须注意在这一时间采血，会有相当一部分药物成分的血药浓度已过或尚未达到高峰。2．4含药血清的处理应用：①血清灭活是含药血清制备技术规范化研究中需要解决的问题之一。血清中含有许多酶、抗体、补体、细胞因子及生物活性物质，这些物质对体外培养的细胞、病毒、病原菌以及用于体外实验的组织器官可能直接产生影响而干扰实验结果，影响药物疗效的客观评价。血清灭活后可排除这些干扰因素对实验结果的影响，有助于减少血清的非药理性干扰，也符合减少微生物感染的常规细胞培养要求]。中药复方制剂因其有效化合物含量较低，作用广泛而缓和，表现为多向性、多层面、多靶点的药理学特点，能调节机体多系统功能，其药效基础除了药物原有效成分外，还有药物作用于机体后产生的内生性有效成分。这些成分可以是抗体、补体、细胞因子、激素、酶、多肽、蛋白质等，经过灭活后可能失去或减少原有疗效。对含药血清的预处理通常有3种方法：丙酮法：血清中加入4～5倍量丙酮，混匀、3000 r／min离心，取上清液温水浴上蒸发，除去丙酮；乙醇法：血清内加入4～5倍95％7,醇，混匀、3000 r／rain离心，取上清液温水浴上蒸发，除去乙醇；加温法：56~C水浴上放置30 min。这3种方法主要去除血清中大部分的蛋白质、糖、部分电解质，血清的正常生物活性基本丧失，容易突出血清中中药的作用。②在体外反应系统中可适当增加血清添加量，如果选择种属较接近的动物血清，浓度可加至100％，即在纯血清内培养。但由于培养基中含有较多营养物质以及含药血清细胞毒性作用，并不是所有的培养系中均可添加高浓度的血清。周明眉研究发现，含药血清反应体系中的稀释浓度以1：4为好。因此，建议在正式试验前进行该实验体系中被培养细胞的血清最大耐受性观察，以确定血清的添加量。

3中药血清药理学的综合评价

　　3．1优势：中药血清药理学方法是以含药血清代替中药粗提物进行体外实验，不仅具有体外实验的优点，还具有明显的优势：①血清不仅是转运药物的载体，也是药物起作用的场所：血清所含成分必定经过体内～系列生物转化，才能成为真正发挥作用的有效成分。这在某种程度上能揭示中药和复方在体内活性成份的转化和改变；②细胞培养中，血清的理化性质与细胞所处的内环境基本等同，排除了制剂本身对实验结果的干扰；⑧中药复方在某种程度上克服复方粗制剂本身理化性质不确定因素对实验结果的干扰，而且相对接近药物在体内生物转化的真实过程，能在一定程度上揭示中药和复方在体内代谢过程中的转化和转变，有助于中药真正有效部位、活性成分的发现。能客观阐明中药的药效和作用机理。采用含中药血清培养细胞可观察到复方经体内胃肠吸收后的综合整体药理效应，同时也可直接观察中药的药物学效应；④从方法学上解决了中药复方直接应用于离体实验的难点，采用含药血清培养细胞，使中药学研究能在离体实验中直接与分子生物学技术相结合，便于应用细胞学和分子生物学手段，从基因、基因产物、药物受体和酶活性等方面阐述药理机制；⑤使现代科学技术与传统医学有了一个切实可行的结合点，有利于应用现代生命科学的技术手段和理论阐述中药复方配伍和相使相须的实质，推动中药的科技进步；⑥避免了直接体外实验可能得出的错误结论。克服了中药制剂的体内代谢物或机体反应物等有效成分引起的假阴性、机体非吸收物质的体外作用造成的假阳性，真实体现了复方药物的体内生化转化效应。对含药血清的成分进行药效、药动学研究并与原复方粗提物进行比较，便于观察和追踪药物的吸收和代谢过程，从而较清楚地认识复方药物中主要药物的有效成分及活性部位，进一步发现中药复方发挥药效作用的物质基础，为探讨中药复方作用规律提供思路；⑦可以验证中医学的一些基本理论，如君臣佐使、中药配伍理论及一些中医基本理论的实际价值，有利于为中医理论的现代化研究提供依据；⑧实验结果与在体实验有较好的一致性，能通过有效成分在血中的动态变化更好地反映中药复方的配伍原则和药物的量效关系；反映可能由药物诱导机体内源性成分产生的作用及中药可能的代谢产物的药理作用，为复方制剂的药理研究奠定基础。3．2作用：中药血清药理学是一门以中药复方或单味中药或中药化学成分血清为药物源，对(人)体外病理模型进行研究的方法学。该方法是体内与体外相结合研究中药药理作用的实验方法。特点是实验结果与在体实验结果有较好的一致性，不但能反映中药(母体药物)及其可能的代谢产物的药理(效)，而且还能反映可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用。①能利用体外实验的优点，比较准确、真实地研究中药的药效和作用机制，特别是微观的作用机理；②能在一定程度上揭示中药和复方在胃肠内活性成分的生物转化和改变；③有助于研究中药复方配伍和相须等“七情”的实质；④有助于中药和中药复方药代动力学研究的开拓与发展；⑤有助于中药中真正有效活性部位、活性成分的发现，为新药开发提供依据。3．3缺陷：目前血清药理学仍处于探索阶段，含药血清的药理研究方法尚不能完全替代在体动物的实验方法。①血清本身内源性成分复杂，中药复方有效成分构成也复杂，两个未知体系叠加在一起，给中药血清药理学研究带来了极大困难；②含药血清在体外反应体系中，血清药物浓度被稀释问题，特别是中药复方制剂中微量成分及蛋白结合率较高的成分，给药物检测和药理实验提出了难题；③含药血清制备：实验动物没有采用病理模型制各动物血清；血清时效、量效关系的确定有待于进一步探讨。没有考虑到空白血清本身的作用，因此没有设立该对照组；④有可能从胃肠吸收的中药成分在体内是进入血浆，而并非血清。血浆是血液中除血球、血小板之外的部分，是无色透明的液体，含有水、无机盐、营养素、激素、尿酸等成分；血清是血浆中除去纤维蛋白后得到的淡黄色液体，在血液凝固后才能分离出来；需要重点区别“血清药理学”与“血浆药理学”。⑤血清中部分物质已经是药物作用机体细胞后的反应产物，如果细胞存在反馈机制，血清二次重复作用于细胞，可能掩盖药物血清的实际作用；⑥含药血清对离体系统同样有干扰，如血清本身对体外酶活性的影响等；⑦辨证论治是中医诊治疾病的方法和特点，尽管实验医学有学者已经将实验和证型相结合，但实验医学中往往忽视中医多采取辨病论治的内涵，由于辨证可以客观反映疾病的内在规律，疾病又是辨证论治的依据，如何将二者结合起来是中药血清药理学需要探讨的问题。

4结语

        虽然血清药理学从概念的提出至今仅20余年的时间，作为一种新的方法学还存在不少问题，但在复方药理学研究中具有不可替代的作用。①复方药物的评价采用血清药理学方法，具有直接、快速、敏感、准确的特点，将广泛应用于复方药物的评价中；②复方药物的机制研究中，血清药理学是主要研究方法之一，随着化学分析手段的完善，复方药物中有效成分逐一确认，其药理学机制终将被揭开；③随着中药血清药理学现存问题的逐渐解决，该方法将更加成熟。药物血清、药物代谢血清、药物作用后的状态血清以及病理血清和分离成分血清将广泛应用于药理学、生理学和病理学的研究中。

        中药血清药理学通过有效成分在血中的动态变化、相互作用及药效的相互关系，更好地反映中药复方的配伍原则和药物的量效关系，在一定程度上揭示中药及其复方在胃肠内处置过程中活性成分的转化与改变，为复方药物的动力学研究奠定了基础，为复方的深入研究提供了一条行之有效的途径。中药血清药理学有利于从细胞水平上探讨中药的作用机理，但这种方法在技术上尚有待探讨和完善。由于细胞在体外培养环境的局限性，使细胞的形态与功能不能与同类细胞完全一致；生态条件的变迁必然带来细胞生物学特性的差异，因此含药血清药理方法不可能完全替代在体(整体)动物的实验方法，在中药及其复方药理学研究中，可以作为能使其更加完善的一种新思路而充实到药理学可供选择的实验方法中。

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