白术挥发油对人肺癌细胞株PG细胞增殖和细胞周期的影响

　　白术为中医治疗肿瘤常用药物，主要含挥发油、内酯类化合物及多糖。挥发油在白术根茎中约占1.4％，其主要成分为苍术酮、苍术醇等。白术在临床上多用于复方中治疗肿瘤；王翕-等研究表明，250mg／kq白术挥发油对肝癌H22、 S180肉瘤小鼠肿瘤有显著抑制作用。张宏桂等研究表明，白术挥发油对动物实验性肿瘤和食管癌细胞株均有显著抑制作用，50-100mg／kg静脉注射对艾氏腹水癌有显著抑制作用。本研究对白术提取物抑制入肺癌细胞株PG细胞的体外增殖作用及机制进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1 　实验材料　白术饮片：购于山东百味堂中药饮片有限公司，白术挥发油由济南宏济堂制药有限责任公司提取，提取后用1％吐温80乳化，稀释为500tμg/ml滤过除菌，-20℃冻存备用。RPMl640培养基：Hyclone公司。新生牛血清：杭州四季青生物制品公司。胰酶、MTT、牛胰核糖核酸酶A(RnaseA)及碘化丙啶PI：Sigma公司。PG细胞株：山东省医学科学院。

　　1.2　细胞培养　PG细胞株常规培养于含10％小牛血清的 RPMll640培养基中，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞加入不同剂量白术挥发油，终浓度分别为白术挥发油250μg／ml、125μg／ml、62.5μg／ml，阴性对照组加入等体积1％吐温80。

　　1.3　PG细胞形态及生长状态　分别于药物处理24、48、72小时后于倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状态变化。

　　1.4　PG细胞生长抑制率　MTT法。取对数生长期PG细胞，O.25％胰蛋白酶消化。收集细胞，BPMII~培养基混悬成密度为4×10⁴／ml的细胞悬液，在96孔板内每孔加入100μl细胞悬液，24小时待细胞贴壁伸展后加入不同剂量白术挥发油，继续培养48小时后每孔加入5mg/ml的MTT10μl，置于细胞培养箱4小时后，吸弃培养基，每孔加150μlDMSO，避光振荡10分钟，至结晶完全溶解。以空白孔调零，用酶标仪测A490光吸收值。每组设5个平行孔，重复实验3次。按下式计算肿瘤细胞生长抑制率。肿瘤细胞生长抑制率=(1-白术挥发油组A490值／吐温阴性对照组A490值)×100％

　　1.5　细胞凋亡和细胞周期变化　流式细胞术检测。

　　1.6　统计学方法　所有数据资料结果以均数±标准差(x±s表示，SPSS10.0软件对配对资料进行t检验。

　　2　结果

　　2.1　白术挥发油对PG细胞形态及生长状态的影响　药物处理24小时后各组细胞伸展好，立体感强，细胞折光性好，可见较多分裂相细胞。药物处理48小时及72小时后，白术挥发油250μg／ml、125μg／ml组可见部分细胞体积增大，细胞立体感变差；细胞折光性差，分裂相细胞较阴性对照组明显减少，培养液中可见较多悬浮细胞及细胞碎片。62.5μg／ml挥发油组与阴性对照组无明显差异。

　　2.2　白术挥发油对PG细胞增殖的影响　白术挥发油250μg/ml、125μg／ml、62.5μg/ml组对PG细胞的生长抑制率分别为58.58％、16.84％、5.96％。白术挥发油250μg／ml、125μg／ml组PG细胞生长抑制率与阴性对照组比较有显著性差异(P<O.01)。

　　2.3　白术挥发油对PG细胞细胞周期的影响　见表1。

　　表1 白术挥发油对PG细胞细胞周期的影响(x±s)

阴性组            -       47.48±4.85    38.81±4.44    10.22±5.36

白术挥发油组  62.5μg/ml  52.53±3.30    38.2l±2.00     10.10±3.10

白术挥发油组 125.5μg/ml  56.99±4.51**  35.70±2.81*    9.97±2.61

　　与阴性组比较*P<0.05，**P<O.01

　　3　讨论

　　近年来白术及白术挥发油抗肿瘤增殖的研究很多。我们前期实验研究表明，白术水煎液能明显降低S180肉瘤小鼠荷瘤生长，调节肿瘤细胞凋亡相关基因Bel-2、P53的表达，白术挥发油含药血清可以降低PC,细胞的克隆形成率。在本研究中，利用体外实验，进一步探讨了白术挥发油抗肿瘤细胞增殖作用及机制。

　　在PG细胞培养液中加入不同剂量的白术挥发油，在不同时间进行倒置相差显微镜观察，随着用药时间的延长及白术挥发油剂量的加大，PG细胞形态变差，分裂相减少，显示白术挥发油对PG细胞有一定的损伤作用，可抑制PG细胞的增殖，这种作用呈剂量时间依赖性。利用MTT法检测不同剂量白术挥发油作用镐小时时对PC细胞的抑制作用，结果显示250μg/ml、125μg／ml白术挥发油对PG细胞的生长抑制率分别为58.58％、16.84％，进一步证实白术挥发油对PG细胞增殖具有抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性。流式细胞术结果显示，白术挥发油250、125μg/ml作用于PG细胞24小时后，G0／G1期细胞增多，S期细胞减少；细胞周期被阻滞于G1期，组间比较差异显著，而白术挥发油62.5μg／ml组和吐温阴性对照组无显著性差异。细胞只有通过G1／S转换点，才能够进入细胞周期，G1期是细胞复制周期运行的关键，也是药物等因素作用的敏感点。白术挥发油处理后PG细胞G1期细胞堆积，不能进入S期，白术挥发油阻滞G1期细胞向S期的进程，从而抑制了PG胞进入细胞周期，进而抑制PG细胞的增殖，自术挥发油对PG细胞周期的影响具有剂量依赖性。

　　本实验结果进一步证实了白术挥发油可以抑制肿瘤细胞增殖，这种作用是通过阻断细胞周期的运行来实现的，并呈剂量依赖性，从而为白术挥发油应用于临床肿瘤治疗提供了理论依据和用药剂量参考。

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