加味补肝汤对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经VEGF表达的干预作用

　　糖尿病周围神经病变(diabetic polyneuropathy，DPN)是糖尿病常见的并发症之一。糖尿病周围神经病变(DPN)的发病与长期严重的高血糖及由此导致的代谢障碍、微循环异常、神经营养因子缺乏、氧化应激自由基增多和自身免疫紊乱等诸多因素有关，其药物治疗临床上缺乏特异性方法。中医药治疗有肯定疗效，通过多年的临床观察，加味补肝汤对周围神经病变有明显的疗效。本室研究表明，加味补肝汤对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病周围神经病变大鼠亦有治疗和预防的作用。目前已明确血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在糖尿病周围神经病变的发生、发展中起重要作用，VEGF在血管和神经元的双重作用使其对治疗DPN发挥重要作用。本文用中药加味补肝汤治疗实验性糖尿病周围神经病变大鼠，探讨加味补肝汤对坐骨神经中VEGF表达的影响。

　　1　材料

　　1．1　动物　选用健康清洁级8周雄性Wistar大鼠80只，体质量200-250g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-003。实验于2007-03-11在湘雅医院中西医结合研究所(国家中医药管理局重点实验室)完成。室温控制在25℃，湿度为70％左右，12小时交替照明。

　　1．2　　主要试剂和仪器　Shandon 325型石蜡切片机：英国 Shandon公司。ACCU-CHEC血糖仪：德国罗氏公司。Motic显微镜：Motic公司。生物信号记录分析系统：广州中医药大学生产。链脲佐菌素：Sigma公司产品。鼠抗VEGF克隆抗体：Santa cruz生物公司，北京中山。SP试剂盒：北京中山。 DAB显色试剂盒：北京中山。其他一般试剂由湘雅医院药房提供。

　　1．3　　加味补肝汤的制备　该方由枸杞15g、木瓜15g、当归 lOg、川芎10g、熟地12g、白芍15g、桑寄生15g、麦冬15g、天花粉15g、全蝎4g等组成，水煎浓缩至2．76g/ml。

　　2　方法

　　2．1　　动物分组、模型制作及给药　Wistar大鼠80只，适应性喂养1周，按照SAS统计软件包产生的随机表，随机将大鼠分为正常组20只、模型组30只、加味补肝汤组30只。模型对照组和加味补肝汤组大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射1％的链脲佐菌素(50mg／kg，pH4．2-4．5，0．1 mol／L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液配制)诱导糖尿病大鼠模型，72小时后尾静脉采血测定血糖，凡血糖>16．7mmol／L者纳入实验。正常对照组20只大鼠禁食12小时后一次性腹腔注射相应容积的0．1mol／L的柠檬酸缓冲液，分别于造模后4、8周测大鼠体重和血糖。造模稳定1周后加味补肝汤组用中药加味补肝汤灌胃治疗，每天按28．6g／kg灌胃(按体重70kg成人临床用量的等效量)。模型组和正常对照组则用等体积的蒸馏水灌胃治疗，实验期间自由饮水和进食。

　　2．2　神经传导速度测定　分别于治疗后第4、8周末进行神经电生理检测。参照Yagihashi等方法并稍加改进：大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350 mg／kg)，麻醉后俯卧固定，刺激电极置于右坐骨切迹(刺激强度2．O v，刺激波宽3．Oms)，在踝部(远端)和右足二趾间分别插入记录电极，参考电极置于记录电极和刺激电极之间，并连接计算机MS302多媒体生物信号记录分析系统，记录远近端坐骨神经产生动作电位的潜伏期，测定两记录电极间的距离，神经传导速度为记录电极之间的距离／动作电位潜伏期之差。测定时保持被检测肢体温度在37℃。分别观察药物治疗后第4、8周末各组大鼠坐骨神经传导速度的变化情况。

　　2．3　坐骨神经内VEGF蛋白表达的测定

　　2．3．1　标本提取　分别于治疗后第4、8周末一次性腹腔注．射10％的水合氯醛(350mg／kg)麻醉，剑突下横切口，沿膈肌与胸廓交界处剪开膈肌，剪断两根肋骨，暴露心脏，用针头与心尖左缘成45-60°方向向上进针，插入升主动脉(同时剪开右心耳)固定针头，快速滴入37℃生理盐水100ml，无血污后改为滴入固定液(4℃，40g/L多聚甲醛PBS1ml／min)250ml。后俯卧位固定，取左侧梨状肌下缘坐骨神经约lcm，置于4％多聚甲醛中固定24-48小时，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚约5μm，每隔20张取2张贴于多聚赖氨酸处理的玻片上，烤干后4℃保存，留做免疫组化。

　　2．3．2　VEGF免疫组织化学检测　二甲苯常规脱蜡，100％、95％、80％、70％酒精梯度水化，蒸馏水充分浸洗；3％H2O2去离子水灭活内源性过氧化物酶10分钟，0．01M PBS(后同)洗5分钟，3次；枸橼酸水浴修复抗原，PBS洗5分钟，3次；滴加正常山羊血清封闭工作液，置湿盒中37℃孵育30分钟，甩去多余液体，勿洗；滴加适当稀释的VEGF抗体(工作浓度为1：100)，置湿盒中37℃孵育1小时，4℃过夜；复温至37℃，PBS洗5分钟，3次；滴加生物素标记山羊抗小鼠Isg，37℃孵育30分钟，PBS洗5分钟，3次；滴加辣根酶标记链霉卵白工作液(S-A／HRP)，置湿盒中37℃孵育30分钟，PBS洗5分钟，3次；DAB显色，显微镜下控制反应时间，有表达后蒸馏水洗5分钟，3次；以终止反应；70％、80％、95％、100％酒精依次梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。分别以抗体稀释液代替-抗作为阴性对照，在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，在Motic显微镜下照相，应用计算机图像处理分析技术对免疫组化结果进行半定量分析，通过Mode Iillages Advanced彩色图文分析系统，测定免疫反应产物VEGF蛋白的光密度值。

　　2．4　统计学分析　数据采用SPSSl3．O软件包完成统计处理。计量结果以均数±标准差(x±s)表示，多组均数的比较采用方差分析，计量资料组间差异比较采用q检验，检验的显著水平为P<0．05。

　　实验过程中，正常对照组无动物死亡，模型组死亡7只，加味补肝汤组死亡6只，最后每组随机取10只进行统计分析。

　　3　结果

　　3．1　　各组大鼠神经传导速度测定见表1。

表1 各组大鼠坐骨神经传导速度测定结果(x±s，m／s)

正常组          10    38．58±2．57     38．51±2．07

模型组          10    26．38±2．18*    23．01±2．40*△

　　与同期正常组比较*P<0．05；与同期模型组比较#P<0．05；与同组前一个时间点比较△p<0．05(下同)

　　3．2　各组大鼠坐骨神经VEGF表达水平的测定结果见表2。

　　表2各组大鼠坐骨神经VEGF阳性产物图像分析结果(x±s)

正常组        10   O．205±0．011    0．208±0．016

模型组        10   0．332±0．015*   O．340±0．019*

　　从免疫组化发现：(1)正常对照组坐骨神经神经纤维雪旺氏细胞及轴突中VEGF表达阳性。(2)在第4、8周时模型对照组坐骨神经纤维中雪旺氏细胞、轴突中VEGF表达呈阳性，髓鞘中也有表达。模型对照组中VEGF阳性表达比正常对照组大鼠明显增多，4周与8周表达无明显差异。经图像分析处理，其平均光密度与同期正常对照组相比P<0．05，与同组前一个时间点比较P>O．05，无统计学意义。(3)用加味补肝汤治疗后，在第4周大鼠坐骨神经纤维中雪旺氏细胞、轴突中的VEGF呈强阳性表达；第8周时，VEGF的表达与4周相比明显减少，两个时间点比较有显著性差异(P<0．05)；与同期模型比较减少，其光密度与同期模型组比较差异显著(P<O．05)。

　　4　讨论

　　糖尿病周围神经病变多归属于中医“消渴”合并“痿证”、“脉痹”等范畴。其病机是燥热亢盛、阴津亏损，调肝养肝、活血通络是治疗糖尿病周围神经病变的重要手段之一。补肝汤出自《医宗金鉴》一书，是滋养肝血的代表方剂，加味补肝汤内川芎、白芍、丹参等活血化瘀中药经现代药理研究证明具有改善血液流变性及微循环作用，从而纠正神经的血流量，故能有效地改善微循环，增加血流量，上调相应的神经营养因子营养神经组织，改善组织的缺血、缺氧，从而能有效地改善DPN的症状。

　　神经电生理检查是诊断糖尿病周围神经病变的敏感指标，可以发现亚临床期的周围神经病变，临床和实验中通常用神经传导速度来检测受试对象是否发生周围神经病变。本研究中，糖尿病模型组神经传导速度慢于正常组，且具有统计学意义(P<0．05)，提示糖尿病神经病变模型造模成功。随着病程延长，神经传导速度逐渐减慢。加味补肝汤治疗后，神经传导速度明显快于糖尿病模型对照组，有显著性差异(P<0．05)，提示加味补肝汤能一定程度预防和改善糖尿病周围神经病变。

　　血管内皮生长因子(VEGF)是最新发现的一种高度特异的促血管内皮有丝分裂因子和作用较强的血管生成因子，又称为血管通透性因子，VEGF不仅是促血管内皮细胞有丝分裂因子，而且也是一种神经营养因子。VEGF对神经系统具看以下作用：促轴突延伸；增加神经元、卫星细胞及雪旺氏细胞存活率；促进神经再生、神经内血管形成等，VEGF在血管和神经元的双重作用使其对治疗DPN发挥重要作用。在糖尿病动物模型中，研究发现其组织和血清中VEGF的表达均有增加，Chattopadhyay等在鼠模型中将VEGF基因转导人脊髓后根神经元(DRG)后证实可以预防糖尿病神经病变的发生，这些研究表明VEGF在DPN的发生、发展和治疗中均发挥着重要作用。我们从实验中发现，糖尿病模型组坐骨神经纤维VEGF表达比正常对照组明显增加，这与以往的文献报道一致，可能是高糖环境下VEGF代偿性增加，发挥营养因子的保护作用。在加味补肝汤组治疗4周时，VEGF表达比模型对照组和正常对照组明显增加，说明加味补肝汤能上调神经营养因子VEGF的表达，通过促轴突延伸，增加神经元、卫星细胞及雪旺氏细胞存活，促进神经再生、神经内血管形成，达到保护神经系统的目的。加味补肝汤治疗第8周时VEGF比同组4周和模型对照组明显减少，我们推测可能是加味补肝汤能够改善糖尿病周围神经的病变程度，神经组织的结构和功能明显好转，对神经营养因子的需求明显减少，故VEGF在加味补肝汤第8周时减少。

　　由此提示：中药加味补肝汤对糖尿病神经病变有明显治疗作用，根据本实验研究结合现代方剂、药理研究推测加味补肝汤的作用可能是通过营养神经组织，从而改善神经组织的缺血、缺氧和组织损伤有关。

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