中药合剂AA-3对SAP大鼠胰腺结构和功能保护作用的研究

　　重症急性胰腺炎(Severe Acute Panematitis，SAP)是一种严重威胁患者生命的急腹症，临床具有病变迅速，病情复杂，并发症多和死亡率高的特点。我院应用中西医结合治疗 SAP，取得了良好的效果。本研究旨在探讨由“通里攻下、活血化瘀、清热解毒”组方的我院自制中药合剂AA-3对SD大鼠实验性SAP胰腺结构和功能的保护作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　实验动物：SD大鼠30只，体重(250±10)g，雌雄不限，由浙江省实验医学动物中心提供。牛磺胆酸钠：购自 Sigma公司，使用前用生理盐水配成5％的浓度，4℃存放。中药合剂AA-3：主要成分为大黄、丹参、蒲公英、生山栀等，由本院制剂室制备，浓度1g/ml，药液经灭菌处理后分装，置4℃存放备用。

　　1.2　实验分组　实验动物标准颗粒混和饲料喂养1周，随机分成假手术组、重症急性胰腺炎模型组、中药治疗组，每组10只。

　　1.3　造模、给药和取材　实验动物用乙醚麻醉，正常组进腹后将胃、十二指肠、胰腺、脾脏提出切口外，再回纳到解剖位置，关腹，饮水保温。模型组和治疗组用Aho’s法制作成 SAP模型，即进腹后将胃、十二指肠提出切口，向助手方向翻转，充分暴露胆胰管、肝门部和十二指肠乳头区域，于胆管出肝门处用小动脉夹阻断，寻找十二指肠乳头开口处，在系膜对侧缘切开十二指肠壁，用PE-50号导管(日本产)逆行插入胆胰管0.5cm，妥善固定，逆行注入5％的牛磺胆酸钠0.1ml／100g，按0.1mb/min的速度注射，完毕后拔管，去除动脉夹，以8-0无损伤缝线问断修复十二指肠切口，逐层关腹，饮水保温。

　　中药治疗组于造模前后2小时，各灌胃中药合剂AA-31次，1ml／100g，其他各组以等量生理盐水灌胃。

　　造模后24小时观察胰腺微血管的血流变化。随即各组腹主动脉采血处死，取各组血清及腹水检测淀粉酶水平，取胰腺组织进行病理学检查和超微结构观察。

　　1.4　病理学观察　胰腺组织病理学半定量分级评定，采用双盲法按Schmidt标准评定胰腺间质水肿，腺泡坏死、出血和脂肪坏死及炎症细胞浸润积分。

　　1.5　胰腺微血管血流变化的观察　荧光显微流速定量系统测试。

　　1.5.1　荧光标记的红细胞的取得　实验前一天，SD大鼠标记，剪掉一小截尾巴，导致微动脉出血，用1％肝素抗凝，取得活性的血液约O.1ml，加入1ml0.067％的异硫氰酸荧光黄(FTTC)溶液孵育过夜(冷藏，4℃)，第二天即可得到FTTC标记的红细胞，简称FTTC-RBC。实验前，不断洗涤该溶液，2000 r／min，5-6分钟，3-4次后上清液无FTTC，取得压积大于90％的FTTC-RBC，待用。

　　1.5.2　实验动物的准备　将正常、模型组、治疗组大鼠再次麻醉。腹腔注射1％戊巴比妥钠(4ml／kg)，麻醉成功后将大鼠仰卧于解剖实验板上，固定行颈静脉插管，再沿腹白线剪开大鼠腹部皮肤，找到胰腺组织，松开大鼠的固定线，移至自制的透明显微用恒温槽，槽内盛37℃的生理盐水。左侧卧位，将胰腺铺在观察台上，稳定后开始观察。

　　1.5.3 　FTTC-RBC注射和显微摄像　将装有制备好的大鼠的恒温槽移至显微镜的载物台上(本次实验使用Olympus BX50显微镜)。选用WH10／22目镜，Olympus20物镜。打开卤素灯和汞灯(100w)，光源预热5分钟，先隔断汞灯激发光，以卤素灯为内光源，透射进行观察。再分别打开Dell P4计算机，为显微记录作好准备。调整载物台的聚位旋钮使胰腺的血管落入视野，搜索感兴趣的微血管网络，找到目标血管后，观察血流，进行录像。用折光片汞灯光路开关，使特定波长的激发光落在待观察的部位，同时通过静脉注射FTTC- RBC1ml，即可在屏幕上观察血流荧光图像，记录整个过程，实验结束后，重放录像对结果进行分析。

　　1.6 　统计学处理　应用软件SPSS11.5统计软件，计量资料多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较用Tukey法。

　　2　结果　模型制成24小时后，大鼠出现血性腹水，浑浊，腹腔内广泛皂化斑，大网膜充血、水肿；胰腺外观水肿、出血、坏死。小肠内容物多，盲肠扩张；肝肿大，表面色泽暗红，脾脏缩小。

　　2.1　各组血清淀粉酶和腹水淀粉酶的比较　见表1。

　　表1 各组大鼠血清和腹水淀粉酶的比较(x±s，U／L)

正常组   10  1258.33±181.37            一

模型组   10  4226.67±848.36**    43341.68±19450.74

　　与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<O.05, △△P<0.01

　　2.2　胰腺组织病理学观察　正常组大鼠胰腺边界清楚，小叶结构完整，未见明显水肿及中性粒细胞浸润，腺泡轮廓清晰，核仁及胞浆成分着色清楚，未见坏死和出血灶，无脂肪坏死，无血管渗出。模型组大鼠胰腺边界不清，小叶结构破坏，间质水肿明显，腺泡细胞呈岛状漂浮，腺泡细胞水肿，腺腔扩张，胰腺组织广泛出血，大量中性粒细胞侵润，大片状舷梯坏死和明显脂肪坏死和钙化灶。中药治疗组大鼠胰腺形态学损害明显减轻，胰腺水肿、腺泡坏死、出血和脂肪坏死、粒细胞浸润及血管周围炎症反应等指标与SAP组大鼠比较差异显著，见表2。

表2  各组大鼠胰腺Schmidt评分比较(x±s，n=10，分)

正常组     0.83±0.37      —         0.75±0.38       0.83±0.37

模型组     3.17±0.75**  3.67±0.47**  3.00±0.64**    3.33±0.74*

　　与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<O.05

　　2.3　胰腺组织细胞超微结构的变化　在透射电镜下，正常组大鼠胰腺腺泡细胞结构正常，具丰富的粗面内质网，发达的线粒体及高尔基体，未见次级溶酶体和大空泡；酶原颗粒结构完整，清晰可见；可见清晰的胞间连接间隙；核膜、核质、核仁境界清晰，结构完整。模型组大鼠胰腺腺泡细胞内出现大量的空泡和次级溶酶体；粗面内质网脱颗粒并呈囊状扩张，线粒体肿胀，空泡样变形，部分线粒体缩小，电子密度增加，高尔基体结构不清；可见肿胀的酶原颗粒；胞间连接紧密，间隙消失；细胞核肿大，核膜脂质双层结构不完整，核质增多，境界不清；部分腺泡细胞退变；膜结构不清，细胞器崩解。中药治疗组大鼠胰腺组织细胞结构基本正常，仅呈现少量的空泡和次级溶酶体；粗面内质网仍然丰富，未见明显脱颗粒现象，仅部分粗面内质网有空泡样变性，部分腺泡细胞线粒体肿胀，嵴模糊和电子密度增加；酶原颗粒结构完整，少见肿胀；细胞间连接间隙存在，结构清晰；细胞核各结构清晰、完整；腺泡细胞滋养血管充盈良好，未见明显的内皮损伤。3组比较SAP组出现明显的胰腺细胞结构损伤，中药治疗组则有明显的形态改善。

　　2.4　胰腺微血管血流变化　在早期大鼠急性重症胰腺炎模型中，观察到同一只大鼠的胰腺微动、静脉存在着不同的血流速度，如有的血流增快，而有的流速则明显减慢，流量减少直至凝滞、停止，治疗组的血液流速则相对一致。

　　3　讨论

　　SAP是始于胰腺缺血，胰酶活化，间质水肿，腺泡坏死继而波及全身各系统器官的炎性过程。中西医结合治疗SAP经过几代人的辛勤工作取得了可喜的成绩。早期足量使用“通里攻下、活血化瘀、清热解毒”中药是SAP治疗必须而重要的组成部分。但是以往的中西医结合治疗SAP的研究，更侧重于研究SAP发生后的全身炎症反应综合征(SIRS)和胰外器官的损伤，对中药保护胰腺本身结构功能的研究相对较少。我们认为胰腺本身的结构功能损伤是之后所有病理过程的始动因素，研究“通里攻下、活血化瘀、清热解毒”中药对SAP时胰腺本身结构功能的保护作用和机理，具有重要的临床意义。

　　胰腺微循环障碍一直被认为是急性胰腺炎(AP)发病原因之一或者是AP向SAP进展的重要因素。AP时组织灌流不足并非外周循环血容量不足造成，而是局部微循环紊乱造成的。胰腺微循环的功能单位是胰小叶，由小叶动、静脉以及连拱样捷径路形成的毛细血管网组成，胰小叶动脉属终动脉。相邻小叶内动脉及其分支无吻合，一旦小叶内动脉出现痉挛，血栓形成或者间质水肿，压迫易造成该小叶动脉支配的胰腺小叶区域发生微循环障碍而出现缺血坏死。

　　本实验研究发现，在急性重症胰腺炎大鼠早期胰腺微循环发生两个事件，即部分微动静脉血流加快，血管通透性增高，微动静脉直接开放，这可能与机体应激、动员有关，与炎症过程中充血时生理反应一致；部分微动静脉出现障碍，小叶动脉痉挛，血栓形成，血液淤滞，血流减慢，甚至停流，组织缺血使该小叶动脉支配的区域发生局部性坏死，蛋白分解酶活性升高。如果胰酶引起血管壁类纤维蛋白坏死造成血管损害，最终发生了胰腺出血。正如Klar所强调的那样，坏死性胰腺炎，微循环方面特征性的改变包括血管舒缩功能的降低，高流量组织主要为水肿改变和低流量组织的进展性坏死的发生。这从一个侧面解释了急性胰腺炎时胰腺水肿与坏死并存，坏死往往是局灶性的。

　　在实验中我们发现，AA-3治疗组大鼠胰腺微动静脉血流速度明显平衡，没有出现过快或者过慢的流速情况。可能缓解了胰腺小叶间动脉痉挛收缩，增加胰腺毛细血管灌注，从而恢复红细胞流速，减轻胰腺水肿或缺血坏死。

　　胰腺组织病理学检查是一种广泛应用于实验性急性胰腺炎判断胰腺病变轻重的既简单又可信的方法，近年来采用了胰腺组织病理损害半定量分级判定，使病理检查更具有客观性和科学性，使得形态学描述量化。实验本结果表明， SAP组大鼠胰腺病理积分，无论单项或总计积分均显著高于对照组，而中药治疗组大鼠胰腺病理积分，则无论是单项还是总计积分均较SAP大鼠有明显改善。

　　电镜技术的应用，使我们能了解组织细胞在疾病条件下超微结构的改变。SAP大鼠胰腺超微结构具有特征性的改变是出现大量的大空泡以及粗面内质网脱颗粒并呈囊状扩张，线粒体肿胀至空泡样变性，酶原颗粒肿胀，胞浆内出现残体。在采用“通里攻下、活血化瘀、清热解毒”组方的中药合剂AA-3治疗后，上述超微结构有明显改善。

　　综上所述，无论AP或者SAP发生时，起始受损的器官无疑就是胰腺本身。SAP更是以局部非感染性炎症开始，在数分钟到数小时内即可以出现SIRS，并逐渐影响全身多个器官的功能。保护胰腺的结构和功能，减少胰腺的损伤，其意义不但在于保护胰腺本身，还直接影响到其他脏器的功能。局部胰腺坏死继而波及全身各系统的炎症病理过程，特别是胰外器官的损伤是急性胰腺炎重症化的标志。在“通里攻下、活血化瘀、清热解毒”理论指导下，中医中药早期及时地参与AP或者SAP的治疗，对减轻胰腺的损伤无疑具有重要的作用。

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