鲜鱼腥草水提物分离纯化的3-艺试验研究

鱼腥草为三白草科植物全草，对其分离、纯化的不同工艺条件得到的提取物进行药理筛选，结果发现，经大孔树脂分离纯化的纯化物具有明显的抗炎作用，总黄酮的含量达60％以上。由于大孔树脂分离纯化天然药物的有效部位，已显示出高效、简单、快速、适于产业化等诸多优点。因此，本试验以槲皮苷、总黄酮、浸膏重为指标，用HPLC法和UV-vis法测定其含量，分别考察水提物的醇沉分离及大孔树脂纯化条件，为合理优化鱼腥草黄酮类化合物分离纯化工艺提供依据。

1仪器与试剂 

  九阳电磁炉；R-202旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)；DZF-6501真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；W205B数控恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；Agilent l100高效液相色谱仪；芦丁、槲皮苷对照品均由中国药品生物制品检定所提供；药用乙醇；α一萘酚、硫酸、氢氧化钠、盐酸等试剂均为分析纯；大孔树脂(天津市海光化工有限公司)；鱼腥草由萧山区中医院药草园提供。

  2方法与结果

  2．1黄酮类化合物的测定

  2．1．1  总黄酮的UV-vis法测定  标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品适量，用无水乙醇配制成1mg·mL的对照品溶液。精密吸取0．1、0．2、0．5、1．5、2．0 mL对照品溶液，加5％氢氧化钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10％Al(NO)，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，定容至25 mL，放置15 min，于最大吸收波长508 nm处检测。以吸光度为横坐标，显色绝对量为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为：y：0．092 7X+O．000 2，相关系数r=0．999 3。结果表明，对照品在O．184 64～2．308 mg(或者吸光度在0．079-0．98)之间呈良好的线性关系。

  2．1．2槲皮苷的HPLC法测定色谱条件色谱柱：Eclipse XDB—C18柱(4．6×150 mm，5μm)；流动相：甲醇-()．4％H3P04溶液(53：47，用三乙胺调pH值为3．0)；检测波长：370 nm；流速：0．8 mL／min；柱温：30~C；理论板数以槲皮苷峰计应不低于3 000。

    标准曲线的绘制：精密称定槲皮苷对照品适量，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容，制成84．8g／mL的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液分别进样O．5、l、2、5、8、10μL，测定峰面积，以进样绝对量(ng)与相应的峰面积计算出回归方程为y=3．334 7X+17．282，R=0．999 6，结果表明槲皮苷在42．4～848 ng呈良好线性关系。

  2．2水提浓缩液的制备取100 kg鱼腥草，加3倍水煎煮二次，每次1h，滤过，滤液浓缩至相对密度1．20±0．05(50℃)，即得。

  2．3上样液的制备条件选择

  2．3．1不同醇沉条件的考察取上述的水提浓缩液适量，用乙醇沉淀使其含浓醇度分别为50％、65％、80％，最后定容至100 mL，取适量过膜，进样。当65％、80％乙醇沉时，槲皮苷的含萤接近。

2．3．2醇沉物洗涤次数考察取适量水提浓缩液，经65％乙醇沉淀，静置，滤过，滤渣继续用65％乙醇洗涤1、2、3、4次后，分别检测其滤液中槲皮苷的含量，计算洗脱率，结果见表2。从表中可以看出，洗涤2次时，槲皮苷洗脱率可达90％。   

上样液的制备：取水提浓缩液适量，用65％乙醇沉，静置，滤过，滤渣用65％乙醇洗涤2次，合并滤液，回收乙醇，再置于水浴上蒸至无乙醇味，记其体积数，即得。    2．4分离纯化条件选择  

2．4．1树脂的比较  分别用三种树脂对总黄酮的吸容量、解吸率试验，可以看出 D101树脂分离纯化效果优于其他两种树脂。   

2．4．2药液载量与树脂用量比的预试  取2．2 cn×25 cm小柱三根(编号：l、2、3)，分别加入处理过的湿树脂47 g，然后再分别加药液(每l mL相当于10 g药材)8、12、16 mL，动态吸附，用水洗脱，别接收1BV、2 BV。1#、2#柱的接收液经盐酸．镁粉反应及聚酰胺薄层层析，以甲醇一水(2：1)为展开剂，1％Al(OH)，显色，加热，365 nmUV灯下观察均

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