白茅根多糖超声提取的优化

    白茅根始载于《神农本草经》，原名茅根，为禾本科植物白茅 lraperata cylindrical(L．)P．Beauv vat．major C．E．Hubb．的根茎，味甘，性寒，具有凉血止血、清热利尿之功。用于治疗吐血、淋病、小便不利、水肿和黄疸等。研究表明，有效成分三萜类化合物和糖类占其总化学成分的18．8％。Eginton和Natory小组对其成分做了大量研究，先后分离出了芦竹素、白茅素、羊齿烯醇以及其他三萜类化合物。白茅根水溶液粗提取物利用凝胶过滤及负离子交换色谱法分离出一系列高分子量的多糖物质，其分子量大于15×10⁴Da。利用化学分析法确定这些多糖中存在6种单糖苷，分别为葡萄糖苷、半乳糖苷、树胶醛糖苷、甘露糖苷、木糖苷、鼠李糖苷。为充分发挥药用功效，本研究以白茅根多糖含量为检 l测指标，用苯酚一硫酸法进行含量测定，考察料液比(g／m1)、提取温度(qC)、超声时间(h)、提取次数等因素，探讨确定超声提取条件下提取多糖的最佳工艺条件。1仪器与试剂

Spectrum54型紫外一可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；KQ一250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；葡萄糖标准品(上海市国药集团化学试剂有限公司)，白茅根(济宁邦尔中药饮片有限公司)经鉴定为禾本科植物白茅，m— perata c似ndrical(L．)P Beauv var．major C．E．Hubb．的根茎。

2  方法与结果

2．1  白茅根多糖的优化提取

2．1．1  标准葡萄糖溶液的配制精密称取干燥恒重的葡萄糖标准品25．2 mg，加适量水溶解，转移到250 ml容量瓶中，加水至刻度，配成浓度为100．8μg／ml标准葡萄糖溶液备用。

2．1．2   5％苯酚试剂的配制取苯酚100 g，加铝片0．1 g和碳酸氢钠0．05 g，蒸馏。收集182℃蒸份，称取7．5 g，加水150 m1溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。

2．1．3  标准曲线的绘制精密量取葡萄糖标准溶液0．1，0．2，0．3，0．4，0．5，0．6，0．7 ml置于干燥试管中，分别加水使成1．0 ml。再分别加入5％苯酚溶液1．6 m1，摇匀，然后加浓硫酸7．0 ml，充分摇匀，室温放置25 min，在490 nm处测定其最大吸收度，同时做一空白。以吸收度(A)为纵坐标，溶液的浓度(μg／m1)为横坐标，得回归方程为：A：0．007 7C-0．045 2，相关系数r=0．999 75，可见葡萄糖的浓度在10．08~70．56(μg／m1)范围内，溶液的吸收度(A)与浓度(μg／，m1)呈良好的线性关系。

2．1．4  正交实验设计白茅根主要有效成分一系列高分子量的多糖物质易溶于水，难溶于有机溶剂。因此，参照超声提取多糖的相关文献资料，白茅根多糖提取工艺可采用不同水量反复提取．选择主要影响提取效率的料液比(g／m1)(A)、提取温度(℃)(B)、超声时间(h)(c)、提取次数(D)作为考察因素，因素水平安排见表1。运用L₉(3⁴)正交实验设计，见表2。

    表1因素水平

2．1．5  白茅根多糖样品的制备

    白茅根样品的处理：称取白茅根小段块300 g(0．2一O．5 cm)，经石油醚(60一90％)500 ml回流脱脂两次，l h／次。再用80％醇回流提取两次，2 h／次，以除去单糖和低聚糖，将药渣(a)烘干备用。

    称量：称量已处理好的白茅根27份，每份5．00 g。

    超声提取：按表3设定的提取温度、超声时间、提取次数和料液比，加蒸馏水进行操作，按条件超声提取，每个实验号做3次平行实验。

    浓缩：合并每次实验的提取液，减压浓缩至150 ml，加少量活性炭脱色，过滤。

    醇沉：滤液加5倍量95％  醇，放置过滤，离心，去除上清液，离心下面的絮状物，在4 000 r／min下，离心15 min。

    洗涤：沉淀用水100 ml溶解重复用乙醇沉淀1次，沉淀用乙醇、丙酮多次洗涤。

干燥：在4 000 r／min下，离心15 rain后，取沉淀物放在电热恒温干燥箱内60％下烘干，即得白茅根多糖。

2．1．6  样品液的配制与测定将白茅根多糖于研钵中研成粉末后，分别置于500 ml的容量瓶中，再从中精密吸取10．0 ml，放入100 m1的容量瓶中作为多糖储备液。精确量取多糖储备液1．0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸收度，代入回归方程，结果见表2。

    由表3 t交实验的结果显示，影响白茅根多糖提取率的因素主次顺序为：提取次数(D)>料液比(A)>超声时间(c)>超声温度(B)。因此，自茅根多糖超声提取的最佳工艺组合为：A₂B₃C₃D₃。

由正交实验的方差分析(见表3)结果显示：提取次数和料液比的差异显著对白茅根多糖提取率的影响起最主要作用，超声时间和超声温度在此实验范围内没有显著差异，对测定结果的影响较小，与直观分析结果(见表2)相吻合。

2．1．7  验证实验取白茅根(a)50 g，加水1 000 ml浸泡过夜后，在80％下超声提取3次，3 h／次。合并3次提取液，加少量的活性炭脱色，减压浓缩至150 m1，加入95％乙醇使溶液含乙醇量达80％，放置过夜，过虑，沉淀用95％  醇、丙酮反复抽洗，得到多糖纯品(I)，60％烘干，称得质量为3．165 g。将其于研钵中研成粉末后精确称量31．65 mg，放入500 ml容量瓶中定容后，取1．Om1，按标准曲线同样的方法测定其吸收度，计算超声提取白茅根中多糖的提取率即百分含量为6．33％。

    多糖的提取率=VCD／m×100

    其中，V：样品溶液的体积(m1)；C：多糖的浓度(μg／m1)；m：称取白茅根的质量(g)；D：样品液的稀释倍数。

表2正交实验结果L₉(3⁴)

表3 方差分析

4  讨论

    在超声提取白茅根多糖过程中，超声提取次数和料液比是影响其提取率的显著性因素，白茅根多糖提取的最佳工艺条件为：超声温度80％，加入20倍量的水，提取3次，提取3 h／次。

    超声波提取法在中草药化学成分提取中的应用已经显示出明显的优势，具有省时、节能、提出率高等优点。超声的作用原理为利用超声波的空化现象，空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了细胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分的溶出。除空化和振动作用外，超声波的许多次级效应，如乳化、扩散、化学效应等也有利于使植物中的有效成分的转移，并充分和溶剂混合，促进提取的进行。

    苯酚一硫酸法简单、快速、灵敏、重现性好，且生成的颜色持久。用苯酚一硫酸法测定多糖含量时需注意苯酚浓度不宜太高，这样反应的稳定性不好且易产生操作误差。本实验采用5％浓度的苯酚与很多文献报道相符，测定结果较为理想。同时保持较高的硫酸浓度对多糖含量测定非常重要，因此该呈色反应是以对多糖的水解和糠醛反应为基础的，硫酸浓度降低会影响两种反应的进行。此外，硫酸的质量非常关键。

    苯酚一硫酸法显色原理为糠醛衍生物与2-萘酚缩合生成有色物质，在490 nm波长处有特征吸收，测定多糖含量。多糖在硫酸存在下先水解成果糖，再衍生成具有呋喃环结构的化合物一一糠醛，甲基五碳糖生成的是5-甲基五碳糠醛，六碳糖生成的是5-羧甲基糠醛。测定吸光度时所用葡萄糖标准溶液与白茅根多糖都需现配现用才能保证结果的稳定性及准确性，每组需平行测定3次。

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