牛膝的研究概况
牛膝为苋科多年生草本植物牛膝Achyranthes bidentata Bl_的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品。牛膝很早就产于河南、山东、江苏等地，但以河南沁阳、武陟一带所产“怀牛膝”疗效好、产量大，是闻名国内外的“四大怀药”之一。牛膝生用散淤血、消痛肿，熟用补肝肾、强筋骨。笔者对近10年来牛膝的有关研究概况综述如下。
l 加工炮制
于当年10月中下旬，牛膝地上部茎叶枯黄时应及时采挖。先将茎叶割掉，刨根要求刨深、刨全，但不要刨断，刨出后剪去芦头，去净泥土，几根捆在一起，架于绳上晒皱至7～8成干时，再扎成小捆晒至全干，削齐即可人药。一般以无芦头、根条粗长、色灰黄者为佳。用双波长扫描法测定不同采收期牛膝根与茎叶甾酮含量，结果
传统加工方法是用硫磺熏，加工后的药材色泽好、平直、柔润、易于贮藏，目前药典未收载该法。有的地方采取直接晒干或晾干，但加工后药材色泽欠佳、弯曲、质地硬、易发生霉变、难贮存。有报道硫磺熏后药材中二氧化硫含量是直接晒干或晾干的1—2倍，认为二氧化硫形成亚硫酸，有漂白、抗氧化的作用。硫磺熏后的不良影响以及熏制次数、时间等工艺参数，有待进一步研究探讨。
牛膝的炮制始见于南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》：“凡使，去头并尘土了，用黄精自然汁浸一宿，滤出，细锉，焙干用之。”唐代孙思邈《备急千金药方》中有“取汁”、“拍碎用之”、“切做细段”等，《外台秘要》中“咀，曝令极干”后用。宋代炮制方法较多。历代文献记载的牛膝炮制品约有20多种，其中以去芦头切段、酒制(酒浸、酒煮、酒蒸、酒炒、酒焙)等较为常用。对炮制的作用也多有记载。明朝李时珍《本草纲目》载：“今唯以酒浸入药。欲下行则生用，滋补则焙用，或酒拌蒸过用。”《本草通玄》中有“欲下行则生用，滋补则酒炒”。清《本草述钩元》中有“行血，生用。人滋补药，酒拌蒸过用”的说明。“所主之病，大抵得酒则能补肝肾，生则能去恶血”是清代对牛膝酒制作用的认识。目前认为牛膝生品长于活血祛淤、引血下行，酒炙后能引血入肾、强筋骨。2005年版《中国药典》载有生牛膝和酒牛膝两种规格。
由于全国各饮片厂及医院对于加酒量、炮制温度与时间等影响因素没有统一标准，故炮制工艺条件较乱，而炮制药材的质量差异较大。杨中林等以牛膝中齐墩果酸的含量为指标，采用正交试验设计得出最佳酒炙条件为加入20％的黄酒、
炮制后成分的变化也逐渐增加。甜菜碱与胆碱的化学结构相似，具有胆碱的一些生理活性，能抗脂肪肝、降压、抗肿瘤，其氯化物还具有抗溃疡作用及治疗胃炎、促进伤口愈合等作用。通过雷氏盐沉淀，采用紫外可见光谱法分析，测得怀牛膝不同炮制品(生品及酒制、炒制和盐制等)中甜菜碱的含量为O．930％-1．029％，不同炮制品与生品中甜菜碱含量差别不大(P>O．05)，说明生品经炮制后甜菜碱没有被破坏和损失，但尚不能从甜菜碱的含量变化来说明炮制对功效的影响。采用火焰原子吸收光谱法测定，怀牛膝生品及3种不同炮制品中均含有10种微量元素，且3种炮制品中都有若干元素含量高于生品，故认为怀牛膝3种炮制品就其10种微量元素的含量来看，酒炙方法效果最好。
2 化学成分
牛膝根所含三萜皂苷水解后生成齐墩果酸及葡萄糖醛酸等，尚含甾体类、糖类、氨基酸、生物碱类和香豆素类化合物，并含有钾盐及多种微量元素。甾体类化合物有蜕皮激素和植物甾醇，蜕皮激素包括羟基促蜕皮甾酮和牛膝甾酮，并从中分离得到了具有免疫活性的多糖组分。
采用硅胶柱色谱等分离手段，利用理化性质与波谱技术对怀牛膝的化学成分进行分离，得到了7个化合物，经鉴定为β一谷甾醇、豆甾醇、齐墩果酸、胡萝卜苷、竹节参皂苷、正丁基β—D一吡喃果糖苷、蜕皮甾酮，其中豆甾醇、齐墩果酸为首次从怀牛膝中分离得到。
反复利用正相和反相硅胶色谱进行分离和纯化，通过理化及波谱分析鉴定化合物结构，结果从正丁醇可溶部分中分离得到6个化合物，分别鉴定为齐墩果酸-3—0一β—D一葡萄糖醛酸苷、竹节参苷1Va、竹节参苷Ⅳa甲酯、竹节参苷IVa丁酯、28-去葡萄糖牛膝皂苷D甲酯和牛膝甾酮，前5个化合物为首次从该植物中分离得到。
用气相色谱一质谱联用法定性、气相色谱法定量，首次分析了牛膝干燥根挥发油的化学成分，共鉴定了45个化合物，特征性成分为2，6一二甲基吡嗪，2一甲氧基一3一异丙基吡嗪和2一甲氧基一3一异丁基吡嗪。
用色谱等方法分离纯化、理化性质和光谱方法研究鉴定武陟县怀牛膝水溶性部分的化学成分，分离并鉴定了，7个化合物，分别为正丁基吡喃果糖苷、尿囊素、齐墩果酸、3—0一β—D一吡喃葡萄糖醛酸、齐墩果酸-28-O-(β-D-吡喃葡萄糖)、蜕皮甾酮、谷氨酸、3-0-(β-D-吡喃葡萄糖)-齐墩果酸-28-O-(β-D-吡喃葡萄糖)。
从怀牛膝乙醇提取物中分离出8个化合物，通过理化常数测定和光谱解析并与文献对照，分别鉴定为a一菠甾醇、β一谷甾醇、大黄酚、邻苯二甲酸二正丁酯、软脂酸、a-菠甾醇葡萄糖苷、胡萝卜苷和蜕皮甾酮。
采用乙醇提取，硅胶低压柱分离法获得两个皂苷单体，经化学和红外光谱(IR)、质谱(MS)、氢核磁共振(1HMR)、碳核磁共振(13CNMR)及c-Hcosy新方法鉴定了结构，分别为牛膝皂苷I和Ⅱ。牛膝皂苷I为3-0-[a-L-吡喃鼠李糖-(1→3)- β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-0-(β-D- 喃葡萄糖)，牛膝皂苷Ⅱ为3-0-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-齐墩果酸-28-0-(β-D-吡喃葡萄糖)。
采用大孔树脂、硅胶、ODS柱色谱分离纯化，经理化常数、光谱学方法鉴定结构，结果分离得到了6个化合物，鉴定了其中的两个，结构分别为3-O-[
从中药牛膝中分离得到一小分子量的果聚糖，经凝胶柱色谱分离纯化后，用ESI—MS测定其分子量分布，根据甲基化、还原裂解乙酰化及GC—MS和NMR分析确证其结构，单糖组成分析表明，牛膝多糖由果糖一葡萄糖(8：1)组成，其数均分子量为1 400 u；糖链中既含有1，2-连接的果糖残基，又含有2，6-连接的果糖残基。牛膝多糖为禾本科型果聚糖。
3 含量测定
3．1 齐墩果酸
牛膝所含三萜皂苷经酸水解后可产生齐墩果酸，含量测定常用薄层扫描法、高效液相色谱(HPLC)法。采用薄层扫描法测得牛膝、盐牛膝、酒牛膝中齐墩果酸的含量分别为(1．30±O．06)％，(1．07±0．03)％和(1．27±0．04)％，生牛膝和酒牛膝含量基本相同，而盐牛膝则偏低，与文献报道牛膝酒炙优于盐炙的结论相吻合。用薄层扫描法测定齐墩果酸含量，结果不同产地栽培牛膝的含量约1．0％，杭州野生牛膝的含量高达1．4％，而土牛膝的含量仅有0．054％，产于河南武陟的怀牛膝含齐墩果酸约为0．99％，北京、湖北房县引种怀牛膝的含量稍高于怀牛膝，故杭州野生牛膝最高，因此只有齐墩果酸含量作为牛膝品质评价或引种是否成功的标准是不够完全的。用薄层扫描法对3个不同产地牛膝进行含量测定，结果河南武陟(1．85％)明显高于其他两个产地(河北1．74％，山东1．45％)，齐墩果酸含量高低反映了皂苷类成分含量的高低，为道地药材的鉴定提供了一个定量依据。采用反射锯齿薄层扫描法(A=527 nm，狭缝为1．
3．2 蜕皮甾酮
采用HPLC法测不同产地牛膝中蜕皮甾酮的含量并评价其质量，结果以河南怀庆府一带(武陟、博爱、沁阳、温县等地)所产牛膝中蜕皮甾酮的含量为高，这与传统认为牛膝以河南省怀庆府所产为道地药材的评价相一致。刘姣等发现，文献中供试品溶液的制备多采用将牛膝粉末置于索氏提取器中，以乙醇回流提取，该方法不能将牛膝中的蜕皮甾酮提取完全，会造成含量测定的结果偏低，用800 mL／L甲醇超声能将蜕皮甾酮较完全地提取出来。
采用HPLC法进行含量测定，结果牛膝中蜕皮甾酮的含量大小顺序为酒炙品(1：12)>生品>酒炙品(1：8)>酒炙品(1：10)。传统酒炙方法中黄酒与牛膝配比为(1：10)，说明按传统方法酒炙后，蜕皮甾酮的含量最低，这与酒牛膝善活血逐淤而补肝肾、强筋骨作用较弱相符，也表明了传统酒炙牛膝方法中黄酒与牛膝配比的合理性。
利用近红外漫反射光谱技术和偏最小二乘法测定牛膝中蜕皮甾酮，结果所建立预测方程中样品的预测值和真实值之间的相关系数为0．9489，证明了该方法应用于中药中化学成分测定的可行性。同其他测定方法相比操作更简单、速度更快，且效率高、无污染、费用低，无需复杂的前处理，可以直接对大量未知样品进行测定。
3．3 羟基促蜕皮甾酮(EDS)
采用RP—HPLC法测定了19个不同产地的怀牛膝中EDS的含量，Hypersil—ODS色谱柱，流动相为乙腈一水(1．0：5．4)，检测波长为243 nm，结果不同产地样品中EDS含量不同，道地怀牛膝的EDS含量并非最高，是否能以EDS含量的多少来评价中药材质量的优劣有待进一步研究。
3．4 多糖
采用酚一硫酸法对8个产地的牛膝进行了多糖含量测定，结果河南武陟、温县、沁阳、博爱和河北安国产的含量高于山西运城、山东泰安、菏泽。
4 指纹图谱
采用红外指纹图谱结合计算机辅助比对软件技术，对14个省32个牛膝样品进行了道地与非道地性的鉴别研究，并对部分不同贮存时间的牛膝进行了对比，以考察其在贮存过程中的变化情况。结果表明，各产地牛膝的相关系数有一定的差异，以0．9840为划分标准，相关系数大于0．9840的为道地牛膝药材(怀牛膝)，小于O．9840的为非道地牛膝药材；通过不同贮存时间牛膝相关系数的变化，可以考察牛膝在贮存过程中是否发生变化及变化大小。 采用HPLC梯度洗脱法，选用Shim—pack VP—ODS色谱柱，甲醇一水梯度洗脱，采用梯度洗脱程序，流速0．8 mL／min，运行时间45 min，检测波长为280 nm，建立可供鉴别怀牛膝药材的HPLC指纹图谱，结果确定了怀牛膝药材有13个共有峰。该法可以作为怀牛膝药材质量控制的方法之一。采用Agilent Zorbax sB—C18柱，甲醇与0．1％甲酸进行梯度洗脱，流速为1．0 mL／min，用HPLC／UV／MS法构建牛膝药材的指纹图谱，结果得到分离度、重现性均较好的牛膝药材HPLC／UV指纹图谱，标示了4个共有峰，并借助HPLC／MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属，为控制其质量提供了依据。
5 结语
牛膝药用历史久远，药源广泛，近年来对其加工炮制、成分、药理作用、提取工艺等方面的研究逐渐深入，对合理开发利用有效中医药资源意义重大。怀牛膝作为驰名中外的“四大怀药”之一，具有巨大的开发潜力。随着社会的发展，人们越来越易于接受以中药来抗衰老、抗肿瘤等，而牛膝具有多方面的药理作用，可以满足这一需要。
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