植物凝集素的研究进展

  植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的蛋白质。随着植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入和分子生物学水平上新的发现，植物凝集素的定义已几经修正，1995年Willy J．Peumans和Els J．M．Van Damme认为确定蛋白质为凝集素的唯一前提条件是至少应有一非结构域，且其能可逆地结合到特异碳水化合物上。

    植物中，不仅种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果实中也发现有凝集素。1888年俄国Dorpt大学的Stillmark首次发现了蓖麻凝集素。1936年Summer and Howell发现凝集素专一性结合糖的性质。1960年Nowell报道了植物细胞凝集素有促进有丝分裂的作用。1975年Becker等研究了刀豆凝集素分子的三级结构，揭开了研究植物凝集素分子空间结构和功能的序幕。

    目前已经发现的植物凝集素近1 000种，广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等众多植物类群中，其中豆科植物凝集素最丰富，有600多种。通过分离鉴定，对它们的性质、分子结构及功能作了大量的研究，许多工作已深入到基因水平。近年来，随着对凝集素研究的展开，人们已认识到凝集素的重要性。现在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。

1植物凝集素的种类

1．1  根据植物凝集素亚基的结构特征，植物凝集素被分成4种类型：

1．1．1部分凝集素(merolectins)  部分凝集素是一类结构域较小的单一多蛋白，只含一个糖结合结构域，它们不能沉积复合糖和凝集细胞。

1．1．2全凝集素(hololectins)  全凝集素也只由糖结合结构域组成，但包含至少两个相同或高度同源的糖结合结构域，此类凝集素有多个结合位点，可以凝集细胞和沉淀复合糖，目前已知的绝大多数凝集素属于此类。

1．1．3嵌合凝集素(chimerolectins)  嵌合凝集素是一类融合蛋白，由一个或多个糖结合结构域及一个具有酶活性或其他生物活性的结构域共同组成。根据其糖结合结构域的数目，嵌合凝集素的性质可能类似于部分凝集素或全凝集素，如多价Ⅱ型(multivalent typeⅡ)核糖体失活蛋白(RIP)可以凝集细胞，而单价工类(monovalent class I)植物几丁质酶基因只有单一的几丁质结合结构域，不能凝集细胞。

1．1．4超凝集素(superlectins)  超凝集素与全凝集素类似，至少含有2个以上的糖结合结构域，而与全凝集素不同的是，超凝集素的结构域不完全相同或相似，它们识别结构不同的糖类。

1．2按结合糖的类型，凝集素可分为6类：

    (1)D一甘露糖或I)_葡萄糖凝集素，如伴刀豆凝集素A(ConA)；(2)N一乙酰氨基葡萄糖凝集素，如麦胚凝集素(WGA)；(3)N一乙酰氨基半乳糖凝集素，如大豆凝集素(SBA)；(4)D-半乳糖凝集素，如蓖麻凝集素(RCA)；(5)L一岩藻糖凝集素，如荆豆凝集素(UEA)；(6)N一乙酰神经氨酸(唾液酸)凝集素，如马蹄蟹凝集素。

1．3根据氨基酸序列的同源性及其在进化上的关系，植物凝集素可以分为7个家族。

1．3．1  豆科凝集素  豆科凝集素是来自豆科植物的一类同源蛋白，是目前研究得最为清楚的凝集素家族，已经从70多种植物中纯化了豆科凝集素，其中大部分来自种子，豆科凝集素还存在于叶片、茎皮、根等营养器官中。所有的豆科植物都由2个或4个分子量约为30 kDa的原体组成，有1个糖结合位点。大多数为金属离子结合的糖蛋白，每个亚基有一个Mn2+和一个Ca2+，它们对于凝集素的糖结合活性是非常重要的。而且按一定的顺序结合，先结合Mn2+，然后其他位点结合Ca2+，这两种结合必须是结合位点处于最优化的构象状态。这一家族在分子水平上存在序列的同源性，特别是那些稳定二、三级结构的序列，或是与亚基间连接、金属离子结合相关的氨基酸残基，以及一些疏水性残基等，但糖结合特异性差异极大。

1．3．2几丁质结合凝集素  几丁质结合凝集素含有一个或多个橡胶素(hevein)结构域。橡胶素是从橡胶树的乳液中分离的，由43个氨基酸组成的小分子蛋白，属于具有一个几丁质结合位点的单凝集素。目前已经在禾本科、荨麻科、罂粟科、商陆科和茄科中发现了，几丁质结合凝集素的存在，它们具有高度的序列同源性。

1．3．3单子叶甘露糖结合凝集素  雪花莲凝集素(GNA)是第一个发现的单子叶甘露糖结合凝集素。之后，在单子叶家族石蒜科、凤梨科、葱科、天南星科、兰科和百合科中都发现了相似的蛋白质，不仅序列上具有同源性，而且都表现出对甘露糖的结合专一性。

    近年还发现，编码单子叶甘露糖结合凝集素的基因是一类相关基因组成的基因家族。对雪花莲属、水仙属等石蒜科凝集素基因cDNA序列分析表明，它们各自都有不同的凝集素基因的表达，可能是有许多同工凝集素存在的原因。

1.3．4  Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)  在20多种植物中发现有Ⅱ型核糖体失活蛋白，如ricin、abrin、modeccin、volk~sin、viscumin和从接骨木中提取的EbulinⅠ等凝集素。Ⅱ型核糖体失活蛋白具有特异的rRNA N一糖苷酶活性，能够催化失活真核细胞的核糖体，由1、2或4个相同的亚基组成，每个亚基包括两个在结构和功能上都不同的多肽。其主要识别半乳糖或N一乙酰半乳糖胺。目前仅有少数II型核糖体失活蛋白的序列已知。

1．3．5木菠萝素(Jacalin)家族  木菠萝素是从木菠萝(Arotocarpus integrifolia)的种子中提取的，对半乳糖专一的凝集素。这一家族根据其糖结合的专一性分为两个类别，一类是半乳糖专一性的，包括木菠萝素和一些桑科凝集素，它们有4个相同的亚基，每个亚基由1个短的p链和1个长的a链组成；另一类是甘露糖专一性的，由多个亚基构成的多聚体，每个亚基由1条肽链构成。

1．3．6葫芦科韧皮部凝集素  此类凝集素位于葫芦科韧皮部，都是分子量约25 kDa亚基组成的非糖基化双体蛋白，识别(GlcNAc)n多糖。随着Glc—NAc多糖链增加到5个，它们的抑制活力增加，表明这一家族凝集素具有扩展结合位点，同时能识别N一糖原中的双一N一乙酰壳二糖基片段。

1．3．7苋科凝集素  许多苋科植物的种子中包含一类对GalNAc具有特异性的凝集素，它们在氨基酸序列和三维结构上与其他的植物凝集素都不同。目前发现的这类凝集素不超过10种，由于最初在苋科苋属植物种子中发现，因此被命名为amaranthin。所有的amaranthins都是由2个同源亚基以头一尾方式排列而形成的二体。糖专一性实验表明amaran—thin可被GalNAc抑制，但与T抗原Gal8(1，3)GalNAc有更高的亲和力。

2植物凝集素的分离纯化

    植物凝集素的分离、提纯及相关生物活性测定，一直是研究者关注的热点。具体的分离纯化方法目前有很多种，基本上都是按照蛋白质分离方法进行。一般先将提取物经硫酸铵分级沉淀，然后通过阴离子或阳离子交换层析。如果此种凝集素的糖结合专一性已知，可以利用亲和层析加以纯化。利用受体制备亲和层析柱，然后用洗脱液进行吸附。注意：前提是所用的介质必须不影响凝集素的凝集活性。还有一种疏水层析，由于很多凝集素具有特殊的疏水接合部位，因此可使用此方法加以分离。这种方’法可以不必考虑凝集素的糖结合活性，可以用水作    由于凝集素自身很不稳定，易受pH、温度及离子等条件变化的影响，加之在生物体内的含量很低，使它的纯化十分困难，同时也阻碍了对它的深入研究。将凝集素粗品纯化的方法种类繁多，文献报道的有DEAE-Sepharose、DEAE-cellulose52柱层析、SephadexG一100、SephadexG-25、CM—sepharose Fast F10w柱层析等。这些方法相互配合使用，形成系列纯化，而且先后顺序各有不同。

3植物凝集素的结构特性

    通过分离纯化，对凝集素的生物学特性、蛋白质的结构与功能及基因的编码顺序进行深入的研究。目前已经获得纯化的凝集素中，阐明氨基酸序列的并不多，多数是对甘露糖(或葡萄糖)专一的凝集素。从已分离的凝集素看，分子量变化范围约为10 kDa～100 kDa，亚基数目为2～4个。关于亚基产生的分子机制，有三种解释：(1)不同亚基是不同基因编码的产物；(2)不同亚基由统一基因编码，但经翻译过程形成分子量相同或不同的肽链；(3)翻译后不同程度的修饰导致。

    现己知道，凝集素与糖的结合是通过其分子中肽链的活性部位，即专一结合糖的区域实现的，与凝集素分子中共价结合的糖无关。凝集素至少应该具有2个与糖结合的位点，而且结合是可逆的。它有以共价键相连接的蛋白质和糖2个部分。其中前者占较大的比例，一般是几个单糖构成寡糖链，再以2种方式与蛋白质肽链相连，分别构成N一连接糖蛋白和。一连接糖蛋白。现已知的糖肽连接键主要有三种：(1)血清型糖蛋白，亦称天冬酰胺一连接或N一连接的糖蛋白；(2)粘蛋白型糖蛋白，糖链与肽链由GalNAcal—Ser／Thr连接；(3)真菌中的Man-Thr连接。凝集素不仅可以识别不同的单糖而且也可以特异结合不同的寡糖。此外，凝集素一糖互作也较好地解释了细胞识别系统的机制。基于细胞表面含有大量的凝集素和糖复合物，使细胞以凝集素为桥梁进行相互作用成为可能。凝集素除了有与糖结合的位点外，还可以与其它生物大分子几丁质、糖脂和多糖等结合。

4植物凝集素基因的克隆

    1982年Hoffman克隆了第一个凝集素基因，它编码一个菜豆凝集素蛋白。现在已有很多凝集素基因被克隆，如p—lectin、WGA、GNA、PTL等。2000年数据库(EMBL)检索表明人们已克隆了2zz个植物凝集素基因，它们大多编码豆科凝集素和单子叶植物甘露糖结合凝集素。    对I已．克隆的凝集素基因进行序列分析可以证实凝集素在分类上的关系，并且可以获得相关凝集素在自然类群上更为详尽的信息。如所有豆科凝集素基因均显示出很大的序列同源性，并且同源性的程度通常还反映出这一家族不同成员之间在分类学上的关系。

    cDNA克隆和Southern杂交分析证实了在不同植物种中，参与表达凝集素的基因数目不同。大多数植物中只有1个或2个凝集素基因或一个小基因家族，只有单子叶植物甘露糖结合凝集素是由大基因家族表达的[g]。

5植物凝集素的应用

5．1在生物学研究中的应用

    细胞表面的糖复合物是细胞间作用的有效成分，精子与卵细胞表面的糖复合物在受精过程中起到重要作用，借助能与糖专一性结合的凝集素的探针作用，人们研究了多种动物及人的生殖细胞表面的糖复合物的分布和变化规律，为动物的遗传育种及种质改良提供重要的理论依据，也对人类的生殖和避孕起到一定的作用Elo]。但迄今为止，该方面的研究只限于人及少数动物，还没有推广到如贝类等具有较高经济价值的无脊椎动物类群。若能利用凝集素分子探针作用来研究贝类配子细胞表面的糖蛋白，并用来指导种质改良和杂交育种，将会促进贝类养殖业的迅速发展，并会带来巨大的经济效益。

    在免疫学上，植物凝集素还是不可缺少的促淋巴细胞有丝分裂剂。在神经学科上，研究神经元表面结构，外周神经元损伤带来的后果及其修复机制，细胞神经递质受体等。

5．2在医学研究中的应用

    细胞癌变、浸润和转移都可能与细胞膜上糖蛋白和糖脂发生改变有关，在胚胎分化、细胞成熟及恶变过程中可有不同的外源性凝集素受体的变化，利用凝集素探针在分子水平上研究细胞表面结构的变化，进一步阐明细胞恶变过程中膜结构的改变。目前，凝集素已用于全身各个系统肿瘤的研究，为探索肿瘤细胞发生发展规律开辟了一条新途径，并有可能成为肿瘤早期诊断、鉴别诊断一个新的指标。

    某些植物凝集素具有毒性，例如属于2一RIP的rlcin、abrin等，研究人员将完整的毒素分子或a链洗脱剂，经济、简便、条件温和且回收率高。作为弹头，利用化学偶联剂与单克隆抗体制备成负疫毒素。一些凝集素具有免疫佐剂的效用，如槲寄生凝集素(ML)，研究认为是一种提高传统抗癌药物敏感性的蛋白质。随着基因工程的发展，植物凝集素已成为一种很有潜力对抗疾病的工具。但是，不能忽视的是植物凝集素也是一把双刃剑，在人肿瘤细胞系和组织培养物中发现，植物凝集素能刺激肿瘤细胞的增生。因此，在进入临床使用之前，植物凝集素的毒性和免疫原性也是必须评估的，以便发挥其在生物学和医学上的作用。

5．3在植物病虫害防治中的应用

    研究表明，许多植物凝集素对鳞翅目、同翅目等害虫及棉枯萎病菌、绿色木霉等真菌和某些细菌有很好的防治作用，同时具有对环境无污染，稳定性好及对高等动物相对安全等优点，成为防治病虫害的又一重要研究对象。

    目前成功地用于植物抗病虫害基因工程的植物凝集素基因主要有：雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、麦胚凝集素基因、苋菜凝集素基因及核糖体失活蛋白基因等[133。在植物中表达凝集素要求相对高的水平才具有较好的抗虫效果，构建强的高效表达载体，采用合适的强启动子，针对害虫取食是韧皮部可采用特异性表达启动子，或与其它的杀虫蛋白相结合提高抗性。具有抗蚜活性的基因应用最多的是雪花莲外源凝集素(GNA)基因。目前报道的转植物凝集素基因的植物有水稻、烟草、马铃薯、小麦、番茄等，均表现出对桃蚜、水稻褐飞虱、菜园夜蛾和麦长管蚜等害虫的抑制和抗性。

5．4在生物固氮中的作用

    生物固氮在自然界氮循环中具有非常重要的意义，提高生物固氮的量不仅可以降低能源消耗还可以减少环境污染。研究最多的生物固氮体系是豆科植物和根瘤菌的共生固氮体系。研究表明根瘤菌是通过对凝集素的识别来浸染植物的，因此，人们提出将豆科植物的凝集素转移到其他植物中去，再接种豆科植物的根瘤菌，就可以使其他植物也被根瘤菌浸染，从而使其他植物也具有固氮的能力。目前，这一研究还处于起步阶段，正在研究将根瘤菌中固氮基因转移到植物中，使植物自己能够固氮。

    植物凝集素作为一种重要的天然产物，种类繁多，随着对其理化性质、生物活性作用及其作用机制的深入研究，将会为生物学、医学、农业研究提供新的研究手段和技术。

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