现代生物技术在中药活性组分筛选中的应用

中药活性组分的确定是中医药现代化这个系统工程中一个十分重要的内容，阐明中药的活性组分，有利于科学地解释中药的作用机理，制定科学的中药生产加工质量控制标准，也有利于实现中药现代剂型的研制及中药的二次开发。传统的中药活性组分筛选的程序是对有效复方或单味药进行化学分离，制备出活性部位或单体，然后利用实验动物进行在体药理活性验证，消耗样品量大、使用大量的实验动物，劳动强度高、耗时耗力，并且一次试验筛选样品量有限，不适合成分复杂的中药活性组分的筛选。高通量药物筛选技术是以细胞水平、分子水平药物筛选模型为主的，结合组合化学、自动化技术建立的大规模筛选药物的方法，该技术的基本思路是直接观察药物与药物靶标的相互作用，使用样品量少，实验周期短，是更为适合成分复杂的中药活性组分筛选的新型技术。 笔者简单的介绍现代生物技术在药物高通量筛选技术中的作用及其在中药活性组分筛选中的应用展望。 l生物芯片技术 生物芯片是指通过微加工技术将生物材料如蛋白质、 DNA、RNA、细胞、组织等有序的高密度的分布在一定的载体上如玻璃、塑料等表面，形成含有大量生物信息的高密度生物样品，将样品与该芯片进行反应，可以获得大量的样品相关信息，极大地提高了检测效率。依据生物芯片所应用的材料不同可分为：基因芯片，蛋白质芯片，细胞芯片和组织芯片。目前技术比较成熟且用于药物筛选的主要是基因芯片和蛋白质芯片。 生物芯片技术的出现有利于同时检测某一种药物或者中药对众多基因或靶蛋白的作用，从而缩短药物筛选的时间和成本，能够在药物和基因之间架起一座桥梁，从而在基因水平、分子水平上解释药物作用机理，有助于从分子水平阐明中药的治疗机制。我国已有学者开始利用基因芯片技术研究中药在基因水平上的作用效果，初步绘制出了一些抗癌中药作用的靶基因谱。以靶蛋白、靶基因或者靶细胞制作相应的芯片，观察药物与芯片上样品的作用情况即可用于筛选药物。生物芯片用于药物筛选研究，使得观察的药物作用靶标不仅仅局限于蛋白质，可以在RNA，DNA水平上进仃，有效的扩大了药物筛选的作用靶标数目，促进了新药发现的机会。同时利用生物芯片易于实现自动化操作，是药物高通量筛选的主要途径，也是中药活性组分筛选，揭示中药治疗机理的重要手段。利用基因芯片比较疾病模型与正常模型基因表达的差异，也可以有效的发现新的药物靶标。Gray等利用基因芯片技术对抗肿瘤药物进行筛选，Wang等用基因芯片技术对鬼臼乙苷(etoposide)的作用机制进行研究， Macbeath等利用蛋白芯片检测蛋白质和小分子药物相互作用取得了成功。 2受体克隆技术 检测药物与靶标或者靶受体的体外结合性能，可以初步获得药物作用机理的信息，克服了整体实验动物筛选提供药物信息少，以及很多疾病没有合适动物摸型的缺点。该方法在化学药筛选中已经逐渐为人们所重视，在中药活性组分的筛选中也进行了一些有益的尝试，如：贺浪冲等提出了利用细胞膜色谱法进行中药活性成分筛选的模型，该模型中，被分析成分如果与特定的细胞膜受体有特异性结合，则色谱保留时间延长，利用该模型对当归、川芎、淫羊藿进行分析获得了较好的结果。 检测药物与受体的作用时，如l可获得高纯度的受体或靶标是成功的关键因素，传统的组织匀浆制备法获得靶标量少、纯度低、成本高，严重制约了该技术的发展。利用重组DNA技术把受体或受体亚型的基因从人体组织中克隆出来，然后在微生物或哺乳动物细胞内表达，该方法有效地解决了受体、靶标的制备问题，吸引着越来越多的人们用重组受体进行药物筛选的研究。鲁春娥、Knopfel等利用该技术制备受体进行相关的药物筛选研究，目前成功地建立了谷氨酸受体、神经肽Y受体、A3肾上腺受体亚型、腺苷A1受体、5-HT受体、肿瘤坏死因子(SrNFRI)受体作为药物靶点进行药物筛选等多种受体并应用于高通量药物筛选。受体克隆技术与亲和色谱技术以及HPLC-MS技术相结合，可以直接检测出与受体相作用的活性组分的化学组成，对于活性组分不甚清楚的中药制剂尤为适用，是一种极有前景的中药活性组分筛选方法。潘远江等以拓扑异构酶为靶标，利用亲和色谱技术结合HPLC-MS建立了抗癌药物的筛选模型。 3动物细胞体外培养技术 用动物细胞体外培养技术进行药物筛选可以从细胞学角度直接观察药物对组织或细胞的作用，可以避免活体研究时效应细胞针对性不强，体内药物代谢反应、种间及个体间的耐药性差异等缺陷。如果想针对性地研究药物对特定组织或细胞的作用，就必须尽量选用相应的细胞株作为实验对象。例如：孟凡迅等人用神经细胞培养法观察单味中药促进神经生长的研究，Keyt B A等以体外培养的肿瘤细胞加入待检物质作用后，检测肿瘤细胞血管生成因子的表达及分泌，用于筛选抗血管生成药物。另外，利用体外培养的淋巴细胞筛选与免疫功能相关的药物，利用体外培养的肿瘤细胞筛选抗肿瘤药物等也有大量的研究。Salida Mirzoeva等利用培养的神经胶质细胞对一氧化氮合成的抑制剂进行筛选，并发现了新的药物作用蛋白靶标。体外培养技术日益成熟和培养用品商品化，使得对很多种药物的筛选研究工作变得十分方便、经济。利用细胞体外培养技术进行中药活性组分筛选消耗样品量少，实验周期短、可同时筛选大量样品，筛选结果较为可靠，是适合中药及其复方制剂的活性组分筛选的现实方法。 4双杂交技术 酵母双杂交技术是研究蛋白质与蛋白质(或多肽)间相互作用的常用技术，蛋白质问的相互作用是生命活动中广泛而重要的作用，与人类许多的疾病发生有密切的关系，因此检测小分子对蛋白质相互作用的影响也成为药物筛选又一新方法。Young等采用N型钙离子通道亚基间的相互作用建立的双杂交系统寻找新型钙离子通道拮抗剂取得了较好的效果。双杂交技术药物筛选是建立在对疾病发生深刻了解的基础上，筛选结果十分可靠，缺点是操作过程比较多，需构建各种载体系统，筛选效率相对较低，在中药活性组分后期筛选中是值得参考的方法。 5噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是研究蛋白质与蛋白质或多肽间相互作用的技术之一，其基本过程是利用基因工程手段将合成的一组一定长度的任意序列的寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面，由于肽库中包含了该长度多肽的所有可能的氨基酸排列顺序或其中的绝大部分，每一个噬菌体呈现其中的一种肽段，因而库容量极大，易于筛选和扩增。通过亲和筛选，可以得到与靶分子具有较高特异性和亲和力的理想目的肽段，这些肽段可以作为候选药物进行开发。Sche P等提出了展示克隆技术，即将小分子用生物素标记后用生物素结合蛋白固定在柱子上，用噬菌体展示相应的靶器官的eDNA库，然后用亲和层析法筛选，最后测定与药物相作用的噬菌体中的靶蛋白的基因，可以知道待筛选的药物的作用靶标及药物本身的活性。随着该技术的进一步完善，相信必定会在现代药物筛选中发挥重要的作用。 6转基因动物 应用实验动物进行药物筛选，是现代医药学发现药物的主要途径，尤其是整体动物的病理模型。建立重大疾病，疑难疾病以及与中医“病证”相对应的动物模型是药物筛选的长期重要任务。转基因技术和基因敲除技术的发展，为建立动物病理模型提供了有利的条件。转基因动物是指用实验方法将外源基因导入染色体基因组内进行稳定整合，并能遗传给后代的一类动物。利用转基因动物模型可以从整体水平直观反映出药物的治疗作用、不良反应及毒性作用，真正体现目的基因的活动特征。利用转基因和基因敲除技术建立敏感动物品系及与人类疾病相同的动物模型用于药物筛选，避免了传统动物模型与人类某种症状相似，而在致病原因、机理不尽相同的缺点，大大缩短了实验时间，加快了药物筛选的速度。目前已培养出较多的转基因动物如：高血压症大鼠，糖尿病大鼠，老年痴呆型大鼠用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、高血压药物的筛选中取得突破性进展。 7生物技术在中药活性组分筛选中的应用展望 关于中药活性组分的筛选，国内外学者已经提出了不少的筛选模型，如田代真一提出的中药血清药理学方法，我国学者丁明玉等提出的生物筛选法，这些方法在筛选活性成分方面都有各自的优点，但是均不能较好的阐明中药活性组分的作用机理的问题，所以基于药物作用靶标、靶分子的高通量药物筛选模型是更适合中药活性成分筛选的可行的技术路线。现代生物技术的发展使得人们可以同时观察药物对多个靶蛋白、靶基因甚至整个组织、个体的基因、靶标的作用情况，这不但符合中药作用多靶点、多途径的作用方式，也符合中医药注重整体性协调的思维模式，所以利用以现代生物技术为基础的高通量药物筛选技术，进行中药活性组分筛选是实现中药现代化的有效途径。 目前，将高通量筛选技术应用于中药活性成分的研究尚极为少见，但在化学药的筛选中已经广泛使用，该技术用于中药活性组分时，只需将化学药改为中药活性组分或者活性部位即可，而筛选系统、检测方法并不需要作大的改变，可以有效的改变传统中药活性组分筛选时样品消耗量大、实验周期长、成本高的缺点。如果将该技术与现代化学分离分析技术如HPIE-MS，GC-MS等相结合，不但可以在短时间内筛选得到活性组分，而且可以对活性组分进行快速的结构判定，避免了常规条件下需要分离纯化出较多量的中药混合物中的各种成分的麻烦，在微量条件下即可得到明确的结果。 Mark A等综述了液质联用技术在高通量药物筛选中的应用情况，指出液质联用技术尤其适用于天然混合物药物高通量筛选，可以达到事半功倍的效果，极大地提高药物筛选的效率，也必将大大促进中药现代化的进程。 摘自：《中国中药杂志》文/李发荣，吴臻，杨建雄

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