系统性红斑狼疮中医证型与外周血Fas及sFas表达相关研究
系统性红斑狼疮(sLE)属于自身免疫病，在免疫学上最突出的特点是B细胞功能亢进，自发产生大量多克隆免疫球蛋白和自身抗体。SLE免疫调节异常日益受到关注，免疫系统与细胞凋亡的关系也日益受到重视。而Fas蛋白在自身反应性淋巴纽胞凋亡的信息传递中起着重要作用。Fas蛋白通过与其配体的结合诱导细胞发生凋亡，Fas蛋白的异常表达将导致自身反应性淋巴细胞的异常，引起自身免疫性疾病。鉴于此，本实验探讨SLE中医证型与Fas、sFas之间的相关性，旨在揭示证的本屁为sLE中医辨证提供客观的实验室依据。
1 主要仪器及试剂
Anti—huIIlan cD95(FAs／APO 1)100T(美国eBioscience)： DFS00 Human FAS (cd95) Quant ikine EL工SA KIT (Catalog Number DFs00，R＆D)；流式细胞仪(美国couLTER公司，EPIcS EIJITE型)；B10一RAD550型酶标仪。
2临床资料
2．1病例来源
33例SLE患者来自2003年12月一2004年9月广东省中医院皮肤科门诊或住院患者，所有患者均符合SLE病、证诊断 标准。男2例，女31例，男女之比1：16．5；平均年龄34岁：其中阴虚内热证16例，脾肾阳虚证10例，热毒炽盛证7例。健康对照组10例来自广东省中医院皮肤科进修者及实习学生，男1人，女9人，男女之比l：9，平均年龄32岁。
2．2纳入与排除标准
纳入标准：符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准，符合《中药新药临床研究指导原则》中有关SLE阴虚内热证、脾肾阳虚证、热毒炽盛证的诊断标准。排除标准：不符合SLE病证诊断标准者，合并有其他严重脏器疾病者。
3研究方法
3．1样本处理
用EDTA—Kz抗凝试管肘静脉采血2 mL，摇匀备用；肘静脉-采3 IIlL无抗凝血，留取血清，
3．2检测指标及方法
外周血淋巴细胞表面Fas的检测：外周血50μL加10μL Fas抗体I孵育15 min；加Optilyse c 500μL，溶液完全透明；加lIIlL PBS混匀；1 500 r／min离心5min，弃上清，加350μLPBs：调整细胞数，上机检测。
sFas的检测：取出所需板条，平衡至室温；在每孔中加入测定稀释液RDl 8 100μL；每孔中加入100μL标准品及样品，薄膜覆盖后，室温放置2 h；用洗液洗板4次；每孔中加入200 uL结合液。用薄膜覆盖后，室温放置2 h；洗板4次；每孔加入200μL底物液。室温孵育30 min，避光；每孔加入50μL终止液；450 nm处检测各孔吸光度值。3．3统计学方法建立数据库，SPSSll．
5进行独立样本的t检验。4结果4·1 系统性红斑狼疮中医证型与Fas表达的相关性
热毒炽盛证与脾肾阳虚证的Fas百分率及平均荧光强度均高于对照组及阴虚内热证，说明此2组PBL表面Fas高表达，对照组及阴虚内热证之间无明显差异。
4·2系统性红斑狼疮中医证型与血清sFas的相关性
各证型SLE患者血清sFas均明显升高，与对照组比较差异显著，但3组之间无明显差异。
5讨论
细胞凋亡异常在SLE发病和病情进展中的重要作用已绢到公认。Fas蛋白在自身反应性淋巴细胞凋亡的信息传递中起着重要作用。Fas的异常将导致自身反应性T、B淋巴细胞凋亡的异常，引起自身免疫性疾病。研究显示：SLE外周血淋巴细胞Fas的表达是增加的，Fas与其配体的结合诱导细胞发生凋亡。Fas的高表达可以解释SLE患者外周血淋巴细胞无论培养前还是培养后均呈现高凋亡状态，不仅如此，凋亡过程中蛋白质的修饰还扩大了自身抗原谱，如酸性糖蛋白P去磷酸化后可以成为自身抗体的靶抗原，激发自身免疫反应Ⅲ。Badillo— Almaraz等。对狼疮肾病患者的肾脏做了病理活检，结果发现 Fas／FasL参与了SLE患者的肾损害，且与疾病的活动度有关。本研究显示，SLE患者热毒炽盛证和脾肾阳虚证外周血淋巴细胞Fas蛋白的表达均高于正常人组(P<0．01)及阴虚内热证(P<0·01)，Fas蛋白诱导外周血淋巴细胞凋亡，这可解释此两型外周血淋巴细胞凋亡率的增高。SLE患者体内有Fas与sFas的异常表达。Fas有膜Fas与sFas两种形式。Fas系细胞表面的跨膜蛋白质分子，是介导凋亡的细胞表面受体。许多组织及细胞均有一定量的Fas表达。sFas是膜Fas的可溶性形式，由于一个编码膜Fas跨膜区的DNA外显子缺失突变造成mRNA改变，因而翻译出缺少跨膜区的sFas。sFas可抑制膜Fas介导的凋亡，改变了淋巴细胞的发育成熟过程，增加了淋巴细胞对自身抗原的反应性增殖，而且发现SLE患者血清sFas水平增高。本研究表明，SLE患者3种证型血清sFas的表达均增高，与对照组比较差异显著∽<0．01)，但3种证型之间无明显差异(P>0．05)；而脾肾阳虚组的sFas的表达最高，这可部分解释脾肾阳虚组外周血淋巴细胞凋亡率低于热毒炽盛证组。但Fas与sFas之间的相互作用以及在SLE中的作用仍须进一步深入研究。
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