葛根素对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响

1材料与方法

1．1和要试剂及仪器

人胚肺成纤维细胞MRC，中国协和医科大学基础医学院细胞中心；MEM/NEAA培养液，中国协和医科大学基础医学院。胰酶，美国Sigma公司产品；葛根素标准品(分析纯，含量>99％)，中国药品生物制品检定所；胎牛血清，Gibco公司产品；噻唑蓝(MTT)，北京科海军舟有限公司；O．1％天狼猩红苦味酸染液，北京海德生物公司。生化培养箱，sANY0公司；酶标仪、流式细胞仪，均为美国B．D公司产品。

1．2  葛根素溶液的配制

以少量二甲基亚砜(DMS0)溶解后，加入MEM／NE从配制成400μg／IIlL贮存液，一20℃闭光保存，2周内有效。使用时用眦M／NE从培养液稀释至所需浓度(DMS0终浓度小于1‰，在本实验条件下1‰DMSO对培养人胚肺成纤维细胞MRc一5无明显影响)。

1．3细胞的培养

MRc一5细胞生长于含10％FBs、100μg／mL青霉素、100μg／mL链霉素的MEM／NE从培养液中，于37℃、5％cOz、饱和湿度的 cO孵育箱中培养，24 h后进入对数生长期，96 h长满瓶底，3～4 d更换1次培养液。

1．4葛根素对MRc一5增生的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的MRc一5细胞胰酶37℃消化5 min，以1|0％胎牛血清的MEM／NEAA培养液制备成1×10ML／ML细胞悬液，接种于96孔培养液板中，每孔200μL，置于37℃、5％C02及饱和湿度的培养箱中培养，至细胞长至单层后，分别在细胞中加入不同浓度的葛根素，同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照，每组设4个复孔。分别继续培养24、48、72、96 h后，每孔加入20μL MTT继续培养4 h，弃上清，加入200μL DMSO，微量震荡10 min，使MTT完全溶解，于自动酶标仪在570 nm波长处测定各孔吸光度A值，实验重复3次。

1．5流式细胞仪测定细胞周期时相变化

    取对数生长期的细胞，以5×105／mL密度接种于25 mL培养瓶中，24 h后换无血清MEM／NEAA培养液继续培养24 h，换用不同浓度的40～400μg／mL葛根素分别作用24 h。对照组不加药，收集贴壁细胞，4℃预冷的PBS洗涤2次，制成单细胞悬液，70％7,醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存，1周有效。检测前用PBS洗去固定液，加入20μL RnaseA，37℃孵育30 min后，暗处加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×105／ML，上流式细胞仪检测，作细胞周期分析。

2．2镜下观察葛根素处理后细胞形态的变化

    对照组细胞：密度低时，细胞长梭形或三角形，有多个细胞质突起；细胞密度高时，以长梭形为主，排列紧密，放射状或涡旋状，边界不清。用药组细胞：胞体收缩，细胞变圆，细胞间隙增宽，分布松散；胞质内颗粒状物增多；高剂量时部分细胞死亡破碎浮起。2．3胶原测定结果，随着葛根素浓度的增加，吸光度越来越小，当浓度≥200μg／mL时，与正常组相比较具有显著差异。这可能说明葛根素首先抑制细胞的生长，而抑制胶原合成是继发的现象。

1．6胶原的检测

采用MTT法检测。取对数生长期的MRC-5，用MEM／NEAA培养液调整细胞数为1×lOs／mL，接种到96孔培养板中，每孔200μL，37℃、5％C0z及饱和湿度的培养箱中培养，12 h后换用无血清培养液，24 h后换用含不同浓度葛根素培养液，另设不加药的正常对照组，每组设4个复孔。分别培养24、48、72、96 h后吸去培养液，每孔加甲醇100μL，-20℃固定一夜，PB5洗1次，天狼猩红室染l h，0．1％醋酸洗3次，每孔加入0．1 tunot／L20μL，室温震荡1 h，于酶标仪540 nm处检测。

1．7统计学方法

采用方差分析及T检验，实验数据采用统计软件SPSSIO．0处理，MTT实验结果以XS表示，P<O．05认为有显著性差异。

2结果

2．1  葛根素对体外培养人胚肺MRC-5细胞增殖的影响

    MTT结果：葛根素浓度>180 μg／mL时能显著抑制MRC-5生长(P<0．05)。40～400 μg／mL的浓度范围，抑制强度随浓度升高而加强(P<0．05)。药物作用时间24～96 h，抑制强度随时间延长而加强(P<0．05)。96 h时葛根素400 μg／IIlL对人胚肺 MRC-5细胞增生抑制作用显著(P<0．01)。

2．4流式细胞仪检测细胞周期实相的分布

    检测结果显示，正常对照组细胞其G。／G。期细胞百分c76．56、80g／nlL的葛根素处理细胞其G／G。期细胞百分比为84．72。由检测结果可知，随着浓度的增大，G。／G期细胞百分比越来越大，说明细胞阻滞于G。／G。期，而进入DNA合成期的细脆减少。3讨论

    肺纤维化是多种原因引起的慢性肺疾病的共同结局，是多种肺疾病发展到晚期的共同病理变化。其集中表现为成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积，在肺部，细胞外基质的主要成分之一胶原即来自于活化的成纤维细胞。由于纤维细胞的异常增殖及胶原的分泌增加在肺纤维化过程中起着重要作用”。因此，抑制肺纤维细胞增殖是防治肺纤维化的一种有效手段。

    本实验以人胚肺成纤维细胞为靶细胞，研究葛根素对成纤维细胞增殖、形态学及胶原表达的影响。结果发现，葛根素能显著抑制其增殖活力及DNA合成，将细胞阻止在G。／G期，并呈剂量依赖性；随着剂量的递增，其抑制作用也明显增强。提示其可能有预防或延缓肺纤维化疾病进程的作用。   

(如果您认为转载内容侵犯了您的权益，请及时联系我们，本网站将在收到信息核实后24小时内删除相关内容。)