中医药对神经干细胞影响的研究概况

姜超 ，赵文树 ，孙申田 (1．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；2．黑龙江中医药大学针灸推拿学院，黑龙江哈尔滨150001) 1 神经干细胞的概念及生物学特性 神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指中枢神经系统中的一类具有多向分化潜能，自我复制，高度增殖能力，在特定条件诱因下，能够向特定类型神经元或神经胶质细胞分化的特殊的未分化或低分化的细胞的总称。特征是：未分化，缺乏分化标记，可增殖即能够自我更新；具有分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的多种分化潜能。 NSCs的特异性标志抗原是神经巢蛋白，或称神经上皮干细胞蛋白(Neuroepithelial stem protein，Nestin)。Nestin是一种新发现的中枢神经系统特有的基因蛋白，属中间微丝族(Ⅳ族)，由于该基因在未分化的神经系统中表达，分化后成熟的神经细胞不表达，因而是NSCs的特异性标志物，主要存在于海马齿状回和脑室旁区。正常情况下，NSCs以静止、不增殖状态存在，并受生长因子、神经递质、周围细胞等内外环境调控，任何一方改变均可能导致NSCs激活。 2中医药对神经干细胞的研究的两个领域和两个方向 两个领域是指利用中医药治疗方法对NSC分别进行体外培养干预实验和在体激发增殖实验。两个研究方向是指利用中药(包括中药复方和某些单体成分)和针灸两种治疗手段分别对NSC的增殖分化进行体内和体外的实验干预。 2。1 中药血清对体外培养神经干细胞增殖分化影响的研究 动物灌服中药后，提取血清用于体外实验是日本学者Hifikolwama首先提出并采用的。该方法不仅可反映药物中可吸收部分的直接作用，也可以反映药物在机体内形成的代谢产物和药物诱生的机体内源性物质，并且排除了粗制剂中非有效成分对实验结果的干扰。动物实验证明，补阳还五汤能促进坐骨神经损伤后的结构和功能恢复，对脑中风后遗症的临床疗效也十分明显。提取的药物血清可促进神经细胞的生长。据此，孙氏等观察了补阳还五汤药物血清对NSC生长分化的影响。取孕12d大鼠胚胎神经管上皮细胞，分别接种在灌服补阳还五汤的鼠血清(不同浓度)和对照鼠血清的培养基内。不同培养时间内观察细胞的生长状况、细胞活性；用MTT法检测细胞活性；用免疫组化染色法检测神经元特异烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达，结果表明，药物血清组NSC的生长明显好于对照组，OD值高与对照组；免疫组化染色显示，NSE、GFAP免疫阳性细胞药物血清组均多于对照组，即表明药物血清组的NSC更多地分化成神经元和神经胶质细胞。表明补阳还五汤药物血清可促进NSC的生长、存活和向神经元及神经胶质细胞的分化。 2．2 利用中药和针灸诱导中枢神经系统损伤后体内神经干细胞增殖与分化的研究 研究人员根据神经系统损伤后内源性NSC可以被激发增殖的特点，利用中药和针灸方法研究对内源性NSC增殖及分化的影响。陈氏等根据中医关于肾藏精、精能生髓、髓通于脑的理论，观察了补虚中药龟板对局灶性脑缺血后神经干细胞的作用。经龟板治疗7d后，实验组缺血区Nesfin阳性细胞数显著多于对照组。实验还观察到，在经龟板治疗7d后，神经缺损评分最低，表明NSC增殖与患肢神经功能恢复同步。提示中药龟板可减轻神经损伤症状和对局灶性脑缺血后NSC有促进增殖作用。杜氏等研究了具有开窍作用的牛珀至宝微丸对局灶性脑缺血再灌注后大鼠脑内Nestin表达的作用。结果表明，在脑缺血再灌注后6h，牛珀至宝微丸组与对照组的皮质、纹状体、室管膜、室管膜下区Nestin阳性细胞数相比，无显著性差异。在缺血再灌注后第7、14、21d，牛珀至宝微丸组上述各脑区Nestin阳性细胞数与对照组相比，均明显多于对照组，并能持续至第21d，且与大鼠患肢功能恢复相关。提示牛珀至宝微丸能促进Nestin表达持续增强，有助于脑缺血再灌注后神经功能恢复。刘氏等研究了脑溢安颗粒对实验性大鼠脑出血后神经干细胞增殖 的影响。采用Rosenberg方法复制大鼠脑出血模型，运 用免疫组织化学法和Western blot方法观察术后1d、 3d、5d、7d后各组动物大脑半球Nestin的表达。结果表 明，模型组和脑溢安组在脑出血后12h，1d Nestin阳性细胞数和Nestin蛋白水平差异不明显，P>0．05；3d后模型组NSC的增殖有所减慢，并逐渐下降，而脑溢安组第3d Nestin阳性细胞数和Nestin蛋白水平与第1d变化不大，第7d仍维持在较高的水平，与模型组相比有显著性差异(P<0．05)。提示脑溢安颗粒能促进NSC的增殖并使之维持一个相当长的增殖期，从而修复损伤组织。李氏等观察了龟板对脊髓损伤大鼠神经干细胞的作用。实验于脊髓外伤造模后1d、7d、14d、21d、28d分别对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能，并应用免疫组织化学技术检测Nestin的表达，用图像分析仪进行定量分析，观察了龟板对脊髓损伤后神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的影响。结果表明，脊髓损伤后第1d，在两组受损伤脊髓灰质中都可见到Nestin的表达，第14d时达到高峰。龟板组为(38．24±6．83)，损伤组为(22．48±7．83)(P<0．05)。 龟板组可使损伤脊髓中Nestin持续高表达至术后第28d，而损伤组仅持续高表达至术后21d。增加的Nestin阳性细胞数量与神经功能的改善平行。结果提示：龟板可减轻神经损伤症状和促进脊髓损伤后神经干细胞的增殖。崔氏等观察了督脉电针对脊髓损伤大鼠神经干细胞的作用。在术后ld、7d、14d、21d和28d分别对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验，检查后肢 功能。并应用免疫组织化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达，采用计算机图像分析仪进行定量分析，观察督脉电针对脊髓损伤后Nestin的影响。结果显示脊髓损伤后第1d，在督脉电针组和单纯脊髓损伤组的损伤脊髓灰质中都可见到Nestin的表达。单纯脊髓损伤组在术后第7d、14d、21d和28d，Nestin阳性细胞数分别为(19．13±3．47)、(21．48±7．83)、(11．78±4．38)、和(9．18±3．26)；而督脉电针组分别为(30．69± 6．16)、(39．24±6。83)、(26．49±5．87)和(x．30±6．61)。两组在4个时间段上均有显著性差异(P<0．05)。增加的Nestin阳性细胞数与神经功能的改善平行。提示督脉电针可减轻神经损伤症状和促进脊髓损伤后神经干细胞的增殖。 2．3 针灸与神经干细胞移植联合应用以促进损伤神经损伤功能恢复的研究 李氏等研究了督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。将实验动物分为对照组、神经干细胞移植组、督脉电针组和督脉电针+神经干细胞移植组。在造模术后及分别治疗后，对各组动物进行BBB评分、爬网格测试、后肢运动录像和皮质诱发电位检测，以及用免疫组织化学荧光染色法观察Nestin阳性细胞、NF阳性细胞和神经胶质酸陸纤维蛋白(GFAP)阳性细胞。干细胞移植组和督脉电针+神经干细胞移植组移植神经干细胞的存活和分化。结果显示，电针加神经干细胞组BBB评分高于神经干细胞组和电针组；在爬网格测试中，对照组大鼠不能攀上平台，神经干细胞组有2只攀上平台，电针组有3只攀上平台，电针加干细胞组5只都攀上平台。无论是皮质体感诱发电位还是皮质运动诱发电位，从其潜伏期还有峰峰值计算，脊髓损伤后导致诱发电位发生显著的潜伏期延长和峰峰值的变小。经电针治疗后，电针神经干细胞组的潜伏期和峰峰值均较电针组和神经干细胞组有显著的改善，但与正常大鼠相比较， (特别是峰峰值)仍有较大差别。结果还显示，在于细胞移植区，有Nestin和NF及Nestin和GFAP双表阳性显色，这表明移植的神经干细胞已有部分分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞，并观察到突起。细胞计数显示，电针神经干细胞组双标阳性细胞的数量与神经干细胞组比较有明显的增加。双侧后肢肌群湿重称量显示，肌肉萎缩最明显的是对照组，而肌肉萎缩较轻的是电针神经干细胞组和电针组，两个组肌群湿重无显著性差异。研究表明，督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。 总之，中医药在诱导NSC增殖和分化上显示出巨大的潜力，随着研究的深入和科技手段的进步，中医药学者有望探索出一条全新的对NSC进行诱导分化的干预调节体系，使中医药在于细胞研究的道路上迈出崭新的一步。

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