镇肝息风汤含药血清对人脐动脉乎滑肌细胞增殖和凋亡作用的实验研究

吴艳霞 孟云辉 涂晋文 涂 欣 田金洲 血管平滑肌细胞(vSMCs)增殖和凋亡是维持血管壁细胞数量相对恒定的一对基本因素，是血管重塑的细胞学基础。高血压病是一种以VSMCs增殖为主要病变的疾病，由VSMC增殖所引发的血管重塑又是心脑血管硬化的病理基础。镇肝息风汤在临床应用能迅速改善阴虚阳亢的客观症状，降压效果明显且对脑、肾等靶器官有保护作用，但其对血管重塑方面的影响尚不清楚。本实验利用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激人VSMCs，观察镇肝息风汤含药血清对VSMCs增殖和凋亡方面的影响，以探讨其作用机制。 1 材料与方法 1．1 实验材料 (1)药物：镇肝息风汤(由怀牛膝30g，代赭石30g，生龙骨15g，生牡蛎15g，生龟板15g，生杭芍15g，玄参15g，天冬15g，川楝子6g，生麦芽6g，茵陈蒿6g，甘草4．5g组成，药物购自汉深大药房，经湖北中医学院中药系鉴定符合国家药典标准)用蒸馏水常规煎煮3次，浓缩至1．5g／ral；依那普利(扬子江制药股分有限公司生产)取lmg溶于5ml水中，配置成浓度为200μg／ml的溶液。(2)动物：雄性SD大鼠40只，体重190-200g，由湖北省疾病预防控制中心提供，随机分为空白对照组、模型组、镇肝息风汤组、依那普利组，每组lO只。(3)主要试剂：DMEM／F12培养基、胰蛋白酶、多聚赖氨酸(Hydone公司)，胎牛血清(三利公司)，AngⅡ、DMSO(Sigma公司)，ATr(Amresco公司)，α一SMCactin一抗、Brdu、Brdu一抗、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德公司)，Annexin V—FTrc试剂盒(晶美生物工程有限公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，Danks，PBS溶液(用分析纯自行配制)。(4)仪器：C02恒温培养箱(Thermo公司)，超净工作台(苏州净化公司)，光学显微镜、倒置相差显微镜(Zeiss公司)，酶标仪(了hermo公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。 1．2 实验方法 (1)含药血清的制备：镇肝息风汤组大鼠按每日30g／kg体重灌服1．5g／ml镇肝息风汤药液，药量按大鼠与成人体表面积比换算I真l。空白对照组灌服同体积生理盐水。均每日2次，连续7d。第7曰给药1-2h后无菌条件下颈总动脉采血，室温静置2-4h，待血凝固后于4℃冰箱过夜，3000rpm离心10min，提取血清，同组血清混匀，0．22μm滤膜滤过除菌，56℃灭活30min，一70℃保存备用。(2)VSMCs的培养鉴定：采用组织贴块法进行人脐VSMCs培养。无菌条件下取出脐动脉，脱去外膜，刮去内膜，分离中层平滑肌，剪成约1mm3的组织块，放人培养瓶中，2h后，使其浸入含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液(含Hepes、NaHCO3，青霉素、链霉素)中进行细胞原代培养。倒置相差显微镜观察细胞呈梭形、束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状，峰处细胞密集、多层，谷处细胞稀疏，甚至未见细胞。α一SMCactin免疫组化鉴定可见VSMCs胞质呈棕褐色。选择生长良好的第3-5代VSMCs用于实验。(3)实验组及处理：将对数生长期的VSMCs用0．25％胰蛋白酶消化后，按1 x 105个／孔细胞接种在96孔板内(200μl/孔)培养24h，换元血清培养基37℃同步化后24h，①空白对照组：不加特殊处理因素；②模型组：AngⅡ10一6mol／L培养液+10％空白血清；③依那普利组：AngⅡ10—6tool／L培养液+10％空白血清+依那普利(200p．g／nd)；④镇肝息风汤组：AngⅡ10一6mol／L培养液+10％空白血清+10％含药血清；每组使终浓度为10-6mol／L，每组8个变孔。(4)含药血清对VSMCs增殖的影响：采用MTT法。以PBS溶解MTT制成5Mg／ml溶液，抽滤灭菌。每孔加入MTT液20μl，37℃继续培养4h，取出培养板，吸出孔中培养液，每孔加入150μl/孔DMSO，振荡10rain，使结晶充分溶解，上酶标仪490nm处测吸光度值(0D)。(5)含药血清对VSMCs DNA合成的影响：采用Brdu免疫细胞化学法。按5 x 105个／孔将细胞接种于放有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板(1ml／孔)中，分组及加药同(3)，用Brdu(10μm)标记的培养液培养40min，去上清液，冷PBS清洗，80％冷丙酮固定lOmin，30％H20：纯甲醇=1：50，室温孵育30min，2mol／L HCl37℃孵育5min，5％BSA室温封闭20min，加鼠抗BrdU抗体4~C孵育过夜，生物素化二抗室温孵育20min，SABC室温孵育20min，DAB显色。分别计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算出标记率。(6)含药血清对VSMCs细胞凋亡的影响：采用流式细胞术Annexin v—FITC法。按5 x 105个／孔将细胞接种于6孔培养板(1ml／孔)中，分组及加药同(3)，将细胞消化后移至EP管中，1000rpmin离心5min，弃上清液，用冷PBS洗涤2次，用结合缓冲液重新悬浮细胞调节细胞浓度为1 x 106／ml，取100μl细胞悬液于5ml流式管中，加入50．1 Annexin v—FITC和10μl Pl(20μg／m1)，混匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加PBS 400山，用流式细胞仪测定，重复3次试验。 1．3 统计学处理 应用SPSSl0．0统计软件。计量资料以(x+s)表示，采用单因素方差分析。 2 结 果 2．1 AngⅡ诱导各组VSMCs增殖的比较 见表1。与空白对照组比较，各组VSMCs CD值增加(P<0.05)；与模型组比较，镇肝息风组OD值降低(P0．05)。 2．2 各组VSMCs DNA合成的比较 见表2。与空白对照组比较，各组Brdu标记率增加(P<0．05)；与模型组比较，镇肝息风组和依那普利组Brdu标记率均减少(P<0．05)。 2．3 各组VSMCs凋亡的比较 见表3。与空白对照组比较，各组凋亡率下降(P<0．05)；镇肝息风组、依那利组与模型组相比凋亡率均增加(P<0．05)。 3 讨 论 镇肝息风汤出自(医学衷中参西录》，具有镇肝息风、滋阴潜阳的功效，主治肝肾阴亏、肝阳上亢、气血逆乱之证。该方剂能降低血压，调节血脂，改善血液流变性，改善高血压肾功能，但血管重塑方面的研究未见报道。 高血压病发生后血管结构改变最主要的特征是血管重塑。血管重塑的细胞学本质主要是VSMCs的改变及细胞外基质的扩充。细胞外基质由VSMCs产生，因此VSMCs的改变是血管重塑的主要内容。VSMCs的增殖一凋亡的失衡可能参与了血管重塑．治疗高血压不仅要降压，更重要的是改善血管重塑，纠正VSMCs的增殖一凋亡的失衡。 血清药理学是近年来提出的一种针对中药复方研究的新的药理学方法，尤其在体外实验中考虑了体内代谢的因素，排除了中药粗制剂杂质的影响，因此符合中药复方发挥疗效的作用方式。由于镇肝息风汤是一含药成分较多的复方，粗制剂的杂质成分、各种电解质或鞣质成分及不同酸碱度的干扰等，均会对培养细胞的生理活性造成一定的影响，故采用含药血清作用于细胞。 近年来研究发现血管组织局部产生的AngⅡ能刺激VSMCs肥大或增殖，在高血压，动脉粥样硬化和经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄等与VSMCs增生和血管壁炎症有关的多种心血管疾病中起着重要作用。本研究发现，AngⅡ可刺激VSMCs增殖．增加Brdu标记率，证实了AngⅡ在体外有促进培养VSMC增殖作用，使DNA合成明显增加，这与文献报道结果一致。本研究证实镇肝息风汤含药血清可抑制VSMCs增殖，促进VSMCs凋亡，从而改善血管重塑。但镇肝息风汤究竟是通过何种信号传导途径对VSMCs增殖、凋亡进行调控，还有待进一步研究。

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