复方肝舒贴的体外释放研究

汤秀珍 刘志远 沈平孃 (国家中药制药工程技术研究中心 上海 复方肝舒贴原为临床经验方，具有活血化瘀、行气止痛、益气通络之功效。含黄芪、莪术、郁金等6味药，其中黄芪中含黄芪皂苷甲、乙、丙(astragalus．saponin I，Ⅱ，Ⅲ)，莪术和郁金中含姜黄素、挥发油等，王不留行中含多种皂苷，夏枯草中含熊果酸(ur—solic acid)，齐墩果酸(oleanolic acid)，芦丁(rutin)，槲皮素(quercetin)等，没药中含挥发油等。 本中心以医用胶为基质，采用现代制剂手段将中药复方制成树脂型贴剂。为考察新剂型的可行性，我们进一步考察了复方肝舒贴中黄芪甲苷、莪术醇等多种成分的体外释放以及经皮渗透性能，为该剂型研究提供理论依据。 一、仪器与材料 ZRS-8G智能溶出试验仪(天津大学无线电厂)；GC-17A型气相色谱仪(日本岛津)；Franz扩散池(上海市中国科学院有机化学研究所)；CS501型超级恒温水浴(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；78-1型磁力加热搅拌器(浙江乐清乐成电器厂)；Camma薄层色谱数码成像系统；Camma薄层色谱自动点样系统：硅胶G预制板(青岛海洋化工厂)。 药材(上海养和堂饮片厂)；复方肝舒贴(国家中药工程技术研究中心自制)；复方肝舒贴中间提取物(国家中药工程技术研究中心自制)；黄芪甲苷对照品(100115-200305中国药品生物检定所)；莪术醇对照品(批号100185-200305中国药品生物检定所)；熊果酸对照品(批号110742-200313中国药品生物检定所)；没药对照药材(批号129671—200202中国药品生物检定所)；王不留行对照药材(批号121094-200302中国药品生物检定所)；所用试剂均为分析纯。 二、实验方法与结果 1．分析方法研究 (1)黄芪甲苷的含量测定方法研究。 君药黄芪中黄芪甲苷为有效成分之一．故以其为定量对象，参照有关文献建立黄芪甲苷的测定方法。 ①薄层层析条件：硅胶G薄层板．以氯仿一甲醇一水(13：6：2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，10％硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘至显色。 ②对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液。 ③扫描波长hs=530nm，kn=700nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。 (2)莪术醇的含量测定方法研究。 莪术和郁金中含有挥发油，而挥发油中主要含有莪术醇、栊牛儿酮、莪术酮、榄香烯等倍半萜成分。为此，建立了莪术醇的测定方法。 ①色谱条件： 色谱柱：OV 1701(30mm*0．32mm*0．25um)：柱温：190℃；进样口温度230℃；检测温度260℃：：载气氮气；分流比2：1；进样量2μL。 ②方法学研究： 在本色谱条件下，空白无干扰；高、中、低3种浓度的回收率分别为101．2％，99．2％，101．6％平均回收率为100．6+1．29％，RSD为1．3％(n=6)。 (3)其他成分的薄层鉴别方法研究。 复方肝舒贴中除了含有黄芪、莪术、郁金外，还含有王不留行、夏枯草、没药等味药，为了能更好地反映复方中其它组合体外释放情况，又建立了这些物质的薄层鉴别方法。 ①以没药、王不留行为对照药材．熊果酸为对照品的TLC： 对照品、对照药材溶液制备：熊果酸对照品5．0mg，加无水乙醇溶解，并定容于10mL，作为熊果酸对照品溶液；没药对照药材0．3g，加无水乙醇50mL，超声提取20min，滤过，滤液减压浓缩至2mL，作为没药对照药材溶液；另取王不留行药材1g，加水30mL，热回流提取0．5h,过滤，滤液减压浓缩至干，加无水乙醇5mL溶解，用硅胶柱(1．5cmxl3cm，200目)分离，先用50mL蒸馏水洗脱，弃去。再用10％甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇lmL使溶解，作为王不留行对照药材溶液。 薄层条件：硅胶G板，以环己烷一氯仿一乙酸乙酯一冰醋酸(20：5：1：0．5)为展开剂；展距为15em；显色剂a碘缸蒸熏．b 10％硫酸乙醇 点样量：供试品5μL，对照品溶液、对照药材溶液各3μL ②以王不留行对照药材为考察指标的TLC： 薄层条件：硅胶G板，展开剂以氯仿：甲醇：水(15：7：2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂。对照药材为王不留行对照药材，展距为15cm，显色剂为碘缸蒸熏。 点样量：供试品5μL，对照品溶液、对照药材溶液各3μL。 2．体外释放度研究 (1)黄芪甲苷的释放度测定。 取复方肝舒贴成品8贴，剪成圆形，3．0g／贴，溶出介质为20％乙醇，温度37℃，转速lOOr．min一。于2，4，6，8，12，18，24，30h不同时间取样。然后减压浓缩干，加甲醇溶解，定容至2mL。按分析方法项下“黄芪甲苷”的方法进行测定，其中供试品溶液2,4,6,8hr的上样量为8uL；12，18，24，30h的为4μL，对照品溶液为2μL。 计算黄芪甲苷的累计释放百分数，结果见图1。 从结果可以看出黄芪甲苷2h释放5％左右，12h已溶出70％以上，以后释放渐缓。 (2)莪术醇的体外释放度研究。 取复方肝舒贴成品12贴，剪成圆形3．0g／贴，溶出介质为20％乙醇，温度37℃．转速100r．min一，于24hr取样，合并溶出液，减压浓缩至无醇味，按药典方法水蒸气提取挥发油，然后按分析方法项下“莪术醇的含量测定”进行测定，计算莪术醇24hr累计释放百分数，结果为53．3％． 由于复方肝舒贴中挥发油量太少，本次实验采用12贴进行实验，并只做了24h的体外释放研究，可以看出莪术醇的体外释放基本完全。 (3)复方肝舒贴中其他有关成分的释放度研究． 复方肝舒贴成品8贴，分别剪成圆形，3．0g／贴．溶出介质为20％乙醇，温度37℃，转速100r．min一．分别经2，4，6，8，12，18，24，30hr释放度实验后，浓缩至干，加甲醇定容为2mL，作为供试品溶液。按分析方法项下的“薄层鉴别”进行分析，结果见图2，3。 如图所见，碘缸显色，供试品图谱与王不留行对照药材和没药对照药材图谱相应位置显相同颜色斑点；10％硫酸乙醇显色，供试品图谱与王不留行对照药材和没药对照药材图谱相应位置显相同颜色斑点，说明复方肝舒贴中的王不留行和没药所含成分也可以从制剂中释放出来。 3．体外透皮研究 (1)裸鼠的处理。 取20g左右的裸鼠，断颈处死，仔细剥离皮肤。除去皮下组织和脂肪、血管(注意不损伤角质层)，用生理盐水冲洗干净不需要立即用于实验的皮肤样品，真空密闭包装后置冰箱低温(一20℃)保存，备用。 (2)试验装置． 实验时选用改进的Franz扩散池。Franz扩散池由两部分组成，上室为扩散室，下室为接收室，中间夹着皮肤。接收室底部连接一个取样管．扩散室直径1．0cm,扩散有效面积0．785cmz,接收室体积6．8ml,接收液为20％乙醇液，磁力搅拌速度为100r／min,单室扩散池水浴温度维持在32±0．5℃。 (3)体外透皮实验研究。 ①莪术醇的经皮渗透试验： 首先考察皮肤对试验的干扰性，通过皮肤空白试验表明，皮肤24h不干扰试验，然后将样品加到扩散室中，24h后收集样品，将透皮接收液转移至分液漏斗，分别用乙醚萃取3次，每次10mL,收集乙醚液．合并，低温挥干，滴加乙醚溶解，按“莪术醇含量测定”项下方法进行分析，结果见表1． 从表中可以看出，莪术油中的莪术醇可以经皮渗透，且随着挥发油量的增大，体外渗透量有增大的趋势。 ②其他成分的经皮渗透研究： 为考察复方肝舒贴中除莪术醇外其他成分的经皮渗透情况，将中间提取物加到扩散池中，透皮24h后，将接收液减压浓缩至于，然后用95％乙醇lmL溶解，做TLC分析，结果见图4-5。 从TLC图谱可以看出，经皮渗透的接受液中有些成分与没药对照药材、王不留行对照药材中的一些斑点可以对应，说明复方肝舒贴中的没药、王不留行中的成分也可以透过裸鼠皮肤。 三、讨 论 1．从复方肝舒贴的体外释放可以看出黄芪、没药、莪术、郁金、王不留行中的成分均可以从制剂中释放出来。其中黄芪中黄芪甲苷2h释放4．81％．12h时可到70％，释放基本完全；其他成分在考察时间范围内均有一定程度的释放。 2．复方肝舒贴处方中没药、莪术、郁金均含有挥发性油类成分，这些成分既可以从基质中释放出来．又可以经皮渗透，探讨复方制剂中挥发性药物的体外渗透具有一定的意义。 3．复方制剂中由于成分复杂，一种成分的体外释放并不能反映全部，所以，本实验采用定量与定性结合的方法，多指标的考察了体外释放以及经皮渗透性能，从而认为可以更全面地反映复方肝舒贴的释放特点．

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