三种黄酮类化合物在高效毛细管电泳中电泳行为的研究

刘玉婕 李国玉 杨炳友 匡海学 (黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040) 高效毛细管电泳作为一种分析手段，20世纪80年代后期在全世界范围内得到了迅速的发展，在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得到了广泛的应用. 本文主要研究了存在于诸多中药中的芦丁、槲皮素、山萘酚3种黄酮类化合物在高效毛细管电泳中的行为与电压、缓冲溶液酸碱度及其离子浓度之间的关系，为探索用毛细管电泳法对不同的黄酮类化合物进行分析测定提供实验基础。 一、实验部分 1．仪器与试剂 P／ACEvaMDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司)，紫外PDA检测器。毛细管为60cm(有效长度50 cm×75 la,m(内径)石英毛细管(河北永年光纤厂)。赛多利斯PB-21型酸度计(德国赛多利斯股份有限公司)。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠均为试剂纯。标准品芦丁(中国药品生物制品检定所)、槲皮素(北京药品生物制品检定所)、山萘酚(中国药品生物制品检定所)为含量测定用。实验所用的其它试剂均为分析纯。 2．样品及缓冲溶液的制备 (l)样品制备。 分别配置浓度约lmg／mL的标准品甲醇溶液。分别取等体积各标准溶液混匀，加少许缓冲溶液．过滤。 (2)缓冲溶液的制备。 ①分别配置浓度为30mmol／L的磷酸一氢钠和磷酸二氢钠缓冲溶液．50mmol／L的氢氧化钠溶液。 ②精密移取①中配置的磷酸一氢钠和磷酸二氢钠缓冲溶液各5mL，加入50mmol/L的氢氧化钠溶液5mL，定容至25mL，混匀，测定pH为7．93。以同法加人不同体积的氢氧化钠溶液分别配置pH为8．44，8．65，9．04，9．42，9．86的缓冲溶液，过滤． ③分别配置浓度为60mmol／L的磷酸一氢钠和磷酸二氢钠缓冲溶液，各取5mL，稀释至浓度为20mmol／L，加浓碱调PH为8．6。同法配置离子浓度分别为30mmol／L、40 mmol／L、50 mmol／L、60 mmol／L的缓冲溶液．过滤. 二、结果与讨论 1．电压与迁移时间、峰形和分离度的关系 在离子对浓度12mmol／L，pH值8．65的条件下．改变电压，观察各峰的行为，结果见图1。以芦丁的出峰时间为工，山萘酚和槲皮素相对于芦丁的出峰时间做表，结果见表1 。 从图1中可见各峰的迁移时间随电压的减小而延长。从表l可知，在pH值和离子浓度一定的条件下，改变电压，山萘酚和槲皮素的相对出峰时间基本无变化，因此改变电压，不会改变各峰之间的分离度。所以电压不是影响各峰分离度的主要因素. 2．pH值与迂移时间、峰形和分离的关系 在电压为20 KV，离子对浓度为12mmol／L的条件下，改变缓冲溶液的pH值，观察各峰的行为，结果见图2。以芦丁的出峰时间为1，山萘酚和槲皮素相对于芦丁的出峰时间做表，结果见表2 从表2中可以看出，在电压和离子浓度一定的条件下，改变pH值，山萘酚和槲皮素的相对出峰时间延长，而且山萘酚与槲皮素之间的相对出峰时间也延长了。因此改变缓冲溶液pH值，会改变各峰之间的分离度，从图2中可见各峰的相对迁移时间延长了，各峰之间的分离度好。所以缓冲溶液pH值是影响各峰峰形、分离度的主要因素(， 3．离子对浓度与迁移时间、峰形和离度的关 在电压为20kv,pH为8．65的条件下，改变缓冲溶液离子对浓度，观察各峰的行为，结果见图3。以芦丁的出峰时间为1，山萘酚和槲皮素相对于芦丁的出峰时间做表，结果见表3。 从表3中可以看出，在电压和pH值一定的条件下，改变缓冲溶液离子浓度，山萘酚和槲皮素的相对出峰时间略有延长，当离子浓度达到一定值时，山萘酚与槲皮素的吸收峰重叠，峰面积为两峰之和。因此缓冲溶液的离子浓度不宜过高。 4．过论 (1)本实验所用仪器的电压范围为0-30 KV．兼顾样品的迁移时间和仪器性能，选择20KV为宜调整电压可以改变电流强度，影响各峰的迁移时间。但对各峰之间的分离度无明显影响。 (2)在本实验中，缓冲溶液的离子浓度主要影响峰形，对各峰分离度无明显影响。样品在缓冲溶液的离子浓度低于40mmol／L的条件下，分离度高，峰形美观。但离子浓度越高，电泳过程中产生的热量越多．增加对制冷剂的消耗，因此根据测试结果，以离子浓度不高于40mmol／L为宜。 (3)黄酮类化合物多具有游离的酚羟基，因此本实验选择pH为8—10的缓冲溶液对其进行测试．结果发现在pH8-9之间，样品的分离度高，峰形美观 (4)从考察的各因素看，缓冲溶液的pH值是影响各峰分离度的主要因素，调节pH值可以改善各峰的分离度及迁移时间。从化合物的结构看，含游离酚羟基越多，迁移时间越长。 三、结 语 通过本实验研究，发现3种黄酮类化合物在毛细管电泳中的迁移行为与缓冲溶液的pH值、缓冲溶液的离子浓度和电压之间存在密切关系，特别是缓冲溶液的pH值是影响3种物质分离度的主要因素。因此，建议在采用电泳法分析研究此类物质时。调节缓冲溶液pH值，以使各物质分离，在此基础上，改变缓冲溶液的离子浓度和电压，调整各峰峰形，以实现对各物质的最佳分析．

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