扶正消瘤颗粒抗卵巢癌作用的体外实验研究

贾 彤 张 献 (黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040) 张广美 (哈尔滨医科大学附属第一临床医学院 哈尔滨 150001) 扶正消瘤颗粒由党参、黄芪、白术、麦冬、枸杞、生地、补骨脂、鳖甲等组成，有益气健脾，滋阴生血功效，原意重在治疗卵巢癌术后化疗引起的一系列毒副作用，经临床观察实验证明，效果显著。以下实验旨在：从体外实验角度探讨本方是否有直接的抗肿瘤作用，并阐述与细胞凋亡间的关系，初步明确其作用机制，为扩展本方的应用范围提供实验依据。 一、材料与方法 1．材料 (1)实验动物及细胞系。选用体重为180+lOg的SD雌性大鼠，由哈尔滨医科大学附属二院动物中心提供，普通环境饲养。人卵巢癌细胞系SKOV-3，由哈尔滨医科大学附属三院妇科提供，12％胎牛血清PRMll640、37℃、5％C02及饱和湿度下培养，每周传代3次。 (2)实验药物。扶正消瘤颗粒由黑龙江中医药大学附属二院制药厂提供；顺铂由昆明三戌贵金属药业有限公司提供，滇卫药准字(1998)第003359号。 (3)实验试剂。MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)，PCNA antibody (mouse monoclonal IgG，Boster)，bcl一2antibody (mouse monoclonalIgGl，Santa Cruz)，b8xantibody(mouse monoclonal IgGzb，Santa Cruz)，peroxi．dase-cojnugated affinipure goat anti-mouse IgG(SantaCruz)，TUNEL kit(ROCHE)，AnnexinV-FITC Apopt0． sis kit(BD) (4)实验仪器。酶标仪(美国Bio-Rad model 550)，电泳及转膜设备(同上)，流式细胞仪(美国BD FACSORT)，透射电子显微镜(日本电子公司JEC一 1220)。 2．左法 (1)含药血清的制备。将大鼠随机分为4组分别为空白组(contr01)、顺铂组(DDP)、扶正消瘤颗粒组(CM)和顺铂+扶正消瘤颗粒组(CM+DDP)除空白组灌胃3ml生理盐水外，其余各组按临床等效剂量，并依据临床常规服药时间及次数给药，即DDP组每只大鼠每d定时腹腔注射1g／kg体重，每d1 次；CM组每只大鼠每d灌胃3次。每次6．25g／200g 体重；CM+DDP为上两组之联合。连续给药至第4d 上午，末次给药1h后，摘眼球取血，室温静置，4℃ 条件下3000rpm离心工5min，小心吸取上清至eppen． doff管中， 置37℃水浴30min， 超净工作台下0．22μm滤膜过滤，0．2mleppendorf管分装，-200℃保存。 (2)MTr法测定含药血清抗SKOV-3的时效性及量效关系。将值对数生长期的SKOV一3接种于96孔板中，每孔5000个细胞(O．1m1)，细胞贴壁后。小心吸出孔内液体，加入无血清卫640继续培养24h．设3个浓度梯度，即lO％、15％和20％，每个浓度设5个复孔，每孔液体总体积为0．15ml，培养48小时后终止；以卫5％为药物浓度，设3个时间段，即24h、48h及72h，准时终止培养。加入MTTl5lLl(5mg／m1)，继续培养4h，吸去液体．加入O．2mlDM—SO，振荡至甲臢完全溶解，上机检测。探测波长490nm，校正波长620nm。以上实验连续3次。取数值均数，excel作图，以吸光度值(存活率)为纵轴．时效关系以小时为横轴，量效关系以药物血清浓度百分比为横轴。 (3)wetern blot检测含药血清干预后的SKOV-3中PCNA、bcl一2及bax的表达。取对数生长期的SKOV-3，弃原培养液，无血清1640继续培养24h，加入含15％药物血清的RPMll640，48h后终止培养，提取总蛋白供wetern blot用。本次实验蛋白上样40／xg．采用15％分离胶，甘氨酸缓冲液电泳2h，转膜60min，化学发光法检测。 (4)流式细胞术检测含药血清诱导SKOV-3的凋亡率。细胞干预方法同1．2．3，培养终止后，收获细胞，按试剂盒说明书上机检测() (5)TUNEL法检测含药血清干预后SKOV-3的凋亡发生。将对数生长期细胞SKOV-3接种在置于24孔板中的盖玻片上，干预方法同1．2．3，终止培养后，TUNEL检测步骤按说明书进行。复染时用伊红．以显示细胞形态。 (6)透射电镜观察含药血清干预后SKOV-3的形态学改变。细胞干预方法同1．2．3，收获细胞后．4℃3％戊二醛磷酸缓冲液固定24h后，常规制作上镜样本观察。 二、结 果 1．MTT结果 由图l、2可见，整体趋势可认为是浓度越大、作用时间越长，对SKOV一3的抑制就越强。从时效关系图上看，在15％浓度的药物血清作用下，CM组在72h后，其抑制率可达41％；DDP组在48h后可达半数抑制率，而CM+pDP组在24h后即可达半数抑制，相对缩短了一倍的时间。从量效关系图上看．control组的细胞数量在3种浓度的药物血清作用48h后，有不同数量的增长，血清浓度较高的生长状况较好。20％CM组的细胞数是10％CM组的细胞数的2倍，20％DDP组的细胞数是10％DDP组的细胞数的8倍，而20％CM+DDP组的细胞数是10％CM+DDP组的细胞数的3倍，是20％的DDP组的细胞数的6倍。 2．Western blot结果 结果显示，CM下调了SKOV-3中PCNA和Bcl-2的表达，上调了Bax的表达，这种趋势在CM+DDP组尤为明显。 3．TUNEL法检测细胞凋亡的结果 control可见SKOV一3细胞为圆形或椭圆形．多核，胞核比例大；CM可见少量细胞形态完整，胞核黄染，为凋亡细胞；DDP可见大量黄染的细胞，失去正常细胞形态；CM+DDP可见完整细胞，胞核黄染，亦可见大量黄染失去正常形态的细胞。 4．透射电镜检测细胞週亡的结果 control可见SKOV-3呈形态不甚规则，表面有粗短的伪足，核有切迹，核仁明显，有丰富的线粒体；粗面内质网较少，而滑面内质网丰富；CM可见细胞体积明显变小，形态不规则，染色质呈斑块样聚集，内膜结构完整，有凋亡趋势；DDP可见细胞体积变小．细胞器数量减少，游离核糖体分布聚集，滑面内质网扩张，粗面内质网脱颗粒，表面绒毛完全消失，呈坏死样的形态较为明显；CM+DDP可见明显凋亡小体．亦可见较为明显的坏死样细胞／) 5．FCM检测细胞凋亡的结果 由表1可见，CM组的凋亡率与control相比，有统计学意义(P<0．05)，而CM+DDP组的凋亡率与CM相比，亦有统计学意义(P<0．05)。 三、讨 论 血清药理学自上世纪80年代被应用以来，20余年的实际操作中，颇多争议，主要集中在所选动物品种，造模与否，给药时间，给药浓度，采血时间，保存方法，选用实验浓度等问题上，制备合格的药物血清是实验能否进行的基础，本实验采用了学者们近年来拟定的较为常用方法。以DDP为阳性对照，实验显示出阳性结果，说明本法确为有效，可以选用。实验在讨论CM的时效关系与量效关系时，选用了普通肿瘤细胞培养时所用10％、巫5％和20％的浓度，笔者在运用血清药理学这一方法时，觉得大多关于中药复方血清药理学的文献提示的是将含药血清作用于体外培养的细胞系后，得出药效学结果，或进一步说明所用血清的药理作用．而血清中的有效成分其理化作用是不明确的，后者多是在复方中药分析实验中进行的，使读者把细胞培养中血清浓度一细胞培养中所用血清量占培养液量的百分比一当做血药浓度。经验证明当培养细胞血清低于5％时，细胞生长受到抑制；高于20％时，高浓度的血清对细胞产生相当毒性或使细胞原有的功能变化，且影响实验结果。结果显示出浓度愈高的血清，作用亦明显，尤其是本药与DDP联合应用时，缩短了半数抑制率的发生时间，使抑制作用提高。 细胞死亡形式一直是肿瘤发生及治疗领域的热点，包括细胞坏死(necrosis)、细胞凋亡(apopto．Sis)，近年来亦提出细胞肿胀(paraptosis)、失巢性细胞凋亡等概念，显示这一领域向精深发展。但其它的细胞死亡形式仍在探讨中，细胞凋亡仍是这一方面的经典。本实验选用TUNEL及透射电镜定性研究了细胞凋亡的发生，并用FCM进行量化分析。实验中7UNEL法与常规方法不同，复染时未用苏木素，而选用的伊红染液，后者上色于细胞质．可以显示出整个细胞形态，与破碎的细胞可形成明显对比。考虑药物血清作用时间和所含药物浓度的不同，采用含15％的药物血清的RPMll640培养48h后，在透射电镜下CM组可见到凋亡的细胞．DDP组可见坏死样的细胞。体外培养的肿瘤细胞。至凋亡晚期时与坏死的细胞在形态上几乎没有明显的差异，而诸多文献均提示DDP可以引起SKOV一3的凋亡发生，故本实验在DDP组可见坏死样的细胞，属于凋亡晚期的肿瘤细胞。在形态上，CM组出现以凋亡为主细胞，DDP组出现以坏死样为主的细胞，而联合组两者并见。FCM结果。联合组的凋亡数量要明显增多。本实验利用westerbblot检测PCNA、Bcl-2和bax的表达，PCNA是检测细胞增殖的影响指标，而bcl-2／bax比率被认为是调控线粒体凋亡途径发生的重要环节之一。实验显示，CM可以诱导bax的表达，而下调bcl-2的表达，使这一比率降低，从而促进细胞凋亡的发生，相应地，细胞增殖受到了抑制 本实验结果趋势基本一致，显示了扶正消瘤颗粒在体外实验中，有一定的抗肿瘤作用，其机制与降低bcl-2／bax比率，促进细胞凋亡发生有关。特别与顺铂联合作用时，效果明显，可协同增效。应该指出的是，体外实验条件易于控制，适合初筛，为了全面评价本方的抗肿瘤作用，应与体内实验相结合，使实验证据更有力，更明确，这也是本课题下一步所要进行的研究。

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