中药中总鞣质含量测定方法比较

柏冬 李强 雷海民 鞣质又称单宁，是一类比较复杂的具有沉淀蛋白质性质的水溶性多元酚类化合物，广泛存在于植物中。以前对鞣质的研究较少，多认为是无用的杂质被除去。近些年来，随着分析、分离手段的进步，逐渐发现鞣质具有许多药理活性，可以抗脂质过氧化、清除活性氧，具有抗艾滋病病毒(HIV)和抗肿瘤的作用，使其在临床中日益受到重视，也同时对鞣质的含量测定方法提出了更高的要求。 皮粉法 鞣质是多元酚类，分子中有许多的酚羟基可以与 蛋白质的酰胺形成氢键结合成不溶于水的沉淀，利用 这个性质可以使鞣质沉淀下来，用重量法测定鞣质的 含量。皮粉法是现在国际上较公认的测定方法。皮粉法 的缺点主要是样品耗用量大，测定时间长，而且没有选择性，其测定结果往往偏高，故一般只适用于测定鞣质含量高的生药，样品较少或含量低的则不适于测定。而且皮粉试剂的供应和质量都较难保证。皮粉法用重量法测定样品须经过滤、干燥、称量，所以需要的样品量较大。而且实验时间较长，一般样品分析需20小时左右，而且皮粉的选择性较差，测定结果偏高。所以皮粉法的使用受到一定的限制。除了皮粉可以作沉淀剂以外，还可以用其他代替，如有报道称用三价离子取代皮粉与鞣质结合进行重量分析，测定双子叶植物中鞣质 的含量。 干酪素法 干酪素主要成分是乳液中的酪蛋白，为含磷蛋白质。分子量约75，000-375，000。干酪素可以有选择性地结合有生物活性的鞣质，与无生理活性的鞣质如鞣千则不产生沉淀，所以干酪素法的选择性较皮粉法好，一般适用于鞣质含量较低的鞣质。鞣质在一定的pH值条件下与Folin试剂反应，利用分光光度法测定其吸收值，再用干酪素沉淀鞣质，再用Folin试剂测定供试品中共存杂质的吸收度，二者之差与鞣质的浓度之间呈线性关系。有研究发现，对老鹳草的鞣质分別采用皮粉法和干酪素法测量，皮粉法测量结 果是6．84％，干酪素法测量的结果是3．32％，表明干酪素法测定的结果更有针对性，一般低于皮粉法测定结果，而且重复性好。 磷钼钨酸一皮粉比色法 《英国药典》2002版鞣质测定法附录采用的是磷钼钨酸一皮粉比色法。即利用鞣质在碱性溶液中将磷钼钨酸还原，产生深蓝色，其吸收度与含量成正比．采用比色法在760纳米下测定。其中，以焦性没食子酸为对照，测定总酚和不被皮粉吸附的酚，二者之差计为鞣质的含量。其中磷钼钨酸的配制方法为取100克钨酸钠固体、25克钼酸盐固体加入700毫升水中，加入100毫升盐酸、50毫升磷酸，加热10小时，再加入150克硫酸锂、50毫升水和0．2毫升溴，煮沸除去多余的溴(大约15分钟)溶液的颜色应该为黄色。 改进的干酪素法 改进的干酷素法其关键步骤是以干酪素代替皮粉．采用磷钼钨酸比色法测定。而且根据鞣质加热不稳定的化学性质，药材样品提取采用浸泡过液代替加热回流提取，提取较完全、方便。有研究表明，pH值在4．8~5．3之间为蛋白质沉淀的最佳条件。英国《药典》采用的是在水溶液中加入皮粉，选择在pH=5的缓冲液中沉淀鞣质。改进的干酪素法采用与焦没食子酸结构相近的没食子酸、鞣酸、d-儿茶素代替，其性质更稳 定，更接近中药的中鞣质的化学结构。 2005版《药典》比色法 2005版<药典》将2000版《药典》皮粉重量法改为磷钼钨酸比色法。用没食子酸作为对照品，用磷钼钨酸比色法进行测定鞣质含量。用水冷浸过液提取鞣质，再用干酪素沉淀非鞣质类成分，两者之差即为鞣质含量。药典含测方法改变之后较原来皮粉重量法准确，重复性及灵敏度高。 络合量法 因为多元酚可与金属离子形成多核络合物，故鞣质能与若干金属离子生成沉淀。因此可利用这个性质测定未知物中鞣质含量。此方法简单，且避免了沉淀转移，洗涤等繁琐的程序，还可省略空白对照实验。因为鞣质化学性质的复杂，目前尚难以络合沉淀反应的克分子关系来推断鞣质的含量。研究发现，用络合滴定法测量綠茶提取物中鞣质的含量，与皮粉法相比没有显著性差异。 氧化还原滴定法 鞣质为多酚类化合物，具有很好的还原性，在常温及酸性溶液中可被高锰酸钾氧化，以此测定鞣质的含量。此法较皮粉法简单、迅速，但高锰酸钾氧化无专属性，测定结果容易偏大。除了高锰酸钾外．常用的氧化还原滴定剂还有硫酸铈等。 比色法 该方法目前应用得最为广泛。常用的显色剂有氯化铁、氯化铁-1、10二氮杂菲一Folin-ciocaltru试剂、5％盐酸一丁醇、甲胺基粉一重铬酸钾溶液、Folin-DAB8试剂、Folin-Denis试剂、偏钒酸铵等。 这些显色剂的检测范围一般在500~700纳米之间，巳被广泛用于果汁、果渣、茶叶和中药中鞣质的测量。有研究人员对啤酒花中丹宁的含量用几种不同方法进行测量，比较发现，高锰酸钾法迅速、简便、快捷、节省试剂；EDTA滴定法较KMnO~,滴定法具有准确、精密、滴定终点清晰、明显等特点；六氰含铁(Ⅲ)酸亚铁钾吸光光度法较钨酸钠吸光光度法具有灵敏度高，色泽稳定，线形范围大、检测浓度低等优点。比色法的不足在于配制Folin-Denis试剂较麻烦，花费时间长，而且遇到其他还原性性物质有干扰。 紫外测定 鞣质在紫外区275纳米左右有较强的特征吸收，可以用紫外法对鞣质进行定量分析。此种方法较简单．迅速。有科研人员利用紫外分光光度法，以鞣酸为对照．在276纳米下测定五倍子、诃子(水解鞣质)、儿茶、大黄(缩合鞣质)鞣质的含量。结果表明，此种方法测定鞣质的含量与皮粉法和络合量法的 结果相近，说明此方法具有一定的可行性。 中药总鞣质测量的各种方法都有其优点和不足。对于不同成分应根据其特点选择适宜的测定方法。对 于测定鞣质单一的成分，近些年发展起来的高效液相技术,既有分离又有检测功能，结果有效而且准确，为鞣质定量分析开辟了新的前景。

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