白背叶根抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

张晓刚，吕志平 ，谭秦湘，钟小兰 (南方医科大学中医药学院，广东广州 510515) 白背叶根为大戟科野桐属植物白揪的根，在我国分布较广，资源丰富。异名白膜根、野桐根，味微苦、涩、性平，有清热、利湿、固脱、消淤等功效。民间常用鲜根水煎服治疗急慢性肝炎。动物实验证实白背叶根具有较好的抗肝纤维化、抗肝炎和抗肝伤作用，为进一步了解白背叶根对HBV复制的影响，我们用HepG2．2．15细胞株为模型，观察白背叶根体外抗HBV活性，并对其作用机理初步探讨。 1材料与方法 1．1 药物白背叶根煎煮，水浴蒸发浓缩为2旷m1，以8层细纱布粗滤后，经1 500 r／min离心10 min，上清液再用定性过滤液纸粗滤,250℃下测pH值为5．09，调节pH值为7．09，再经0．22 Ixm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放备用。干扰素01b(赛若金)由深圳科兴生物工程股份有限公司提供，10万IU／支(实验用药)。 l．2细胞培养Hep G 2．2．15细胞来自南方医科大学(原第一军医大学)全军病毒性肝炎重点实验室。将HepG 2。2．15细胞接种于DMEM混合培养液(含20％胎牛血清、0．03％L．谷氨酰胺、100 U／ml青霉素、100 U／ml链霉素、380μg/mlG418，置于37℃、饱和湿度、5％C02培养箱中培养。换液1次／3 d，6-10 d传代。每次换液留取上清，检测HBV-DNA分泌情况，表达稳定后开始实验。 l．3 药物对HepG 2．2．l5细胞的毒性实验根据Sargent JM等建立的MTr比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。将白背叶根提取液用DMEM混合培养液分别稀释成l 000，500，250，125，62．5，31．25，15．63，7．82，3．91，1,96 mg/m1和1 000，500，250，125，62．5，31．25，15．63，7．82，3,91，1．96pg/m!等20个实验浓度，培养细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为10 x 104／ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔O．1 ml,37℃、饱和湿度、5％C02培养，于48 h后换人不同浓度含药DMEM混合培养液，同时设无药物细胞对照组，每浓度4孔，每4天换新鲜含药培养液，共2次。第8天每孔加入MTr溶液(1 mg／ml)200μl，继续在37℃下孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清，然后每孔加入150 μDMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解，置人酶联检测仪中以570 am波长测定各孔光吸收值(OD值)，重复3次，依照Reed-Muench法计算药物对HepG 2．2．15细胞的抑制百分率(％)：(细胞对照组平均A组一实验组平均A值)／细胞对照组平均A值x 100％；细胞半数有毒浓度(JPTCso)：Antilg[1gO+(50—B)的抑制百分率／(A一B)的抑制百分率)x C]x 100％，治疗指数(”)：半数有毒浓度(TC5o)／半数有效浓度IC50.TI>2为有效低毒12为低效低毒TI<2为毒性作用。注：A：lg>50％药物浓度，B=1g<50％药物浓度，C=lg稀释倍数。 1．4 药物应用培养细胞用胰岛蛋白酶化，配制成浓度为10 x104／ml的细胞悬液接种于24孔培养孔，每孔1 ml，37℃、饱和湿度、5％C02培养，根据药物毒性度验结果，于48 h后换人6种不同浓度(3l．25，l5．63，7．82，3．91，I．96，0．98 mg/ml的细胞全培养液，阳性对照药物为干扰素01b(赛若金100，200，400IU)，同时设不含药物的细胞对照组。每4天换新鲜含药培养液，共2次，于第4，8天留取培养液作为检测标本一20~C保存，同批次试剂同一时间检测。 1．5 上清液中HBsAg，HBeAg的检测采用微粒酶免疫(MEIA)测定技术(美国Abbott公司AXSYM全自动免疫分析系统及试剂盒)检测，结果以S／CO值表示。抑制率：(细胞对照组S／CO值一药物组S／CO值)／细胞对照组／S／CO值x 100％。 l．6 上清液中HBV-DNA的提取及定量检测采用PCR荧光定量技术检测上清液中HBV DNA定量。每个浓度重复测定3次，取平均值。HBV DNA抑制百分率(％)：(细胞对照组平均A值一实验组平均A值)／细胞对照组平均A值x100％。 1．7 统计学分析结果用x±s表示，组间比较用方差分析，采用SPSSll．0完成。 2 结果 2．1 白背叶根的细胞毒性实验结果显示，不同浓度的白背叶根对HepG2 2．2．15细胞均有不同程度的毒性作用，随着药物浓度增高，毒性作用逐渐增强，图l显示药物作用8 d后对HepG2．2．15细胞的生长抑制情况。白背叶对HepG2．2．15细胞的TC5o为48．25 mg/ml.实验结果初定确定了用药浓度范围。从表1可见，白背叶根对HepG2．2．15细胞分泌的HBsAg、HbeAg均有抑制作用，并且随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高；随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高。在同一浓度下，都表现为对HBeAg的抑制率高于对HBsAg的抑制率。白背叶根浓度在31．25 mg/ml时作用4 d对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到26．27％，58．63％(P<0．01)，作用8 d对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到59．74％，78．29％(P<0．01)，其ICso分别为3．64，1．12 mg/m1，对抑制2．2．15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13．26和43．08。 2．3 白背叶根对HBV DNA的抑制效果如表3所示，白背叶根对HepG2．2．15细胞分泌的HBV DNA仅有轻微抑制作用，随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高；随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高，但与细胞对照组比较，无统计学意义。赛若金250 IU／ml组及500 IU／ml组对HepG2．2．15细胞分泌的HBV DNA有明显抑制作用，并且随着药物作用时间的延长，抑制率逐渐增高(作用4 d时P<0．05，作用8 d时P<0．01)。 3 讨论 HepG2．2．15细胞株是共转染法将克隆的HBV DNA及抗G418质粒转染人肝癌细胞株HepG细胞所建立的，能转录、翻译HBV基因，并能长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg，HBeAg和完整的Dane颗粒，是目前国内外公认和常用的体外评价HBV药物的细胞模型。对HepG2．2．15细胞培养中HBV DNA及其抗原的动态分析表明：细胞外HBV DNA水平与病毒抗原具有显著相关性，而细胞内HBVDNA水平与病毒抗原的相关性无统计学意义。为此，我们选择HepG2．2．15细胞分泌至培养上清液中HBV DNA及其抗原的变化作为观察指标，以判断白背叶根的抗HBV疗效。 以往应用Hep G2．2．15筛选抗HBV药物的实验多采用Southren杂交、斑点杂交等方法测定HBV DNA，采用ELISA方法测定HBsAg和HBeAg，但这些方法存在敏感性低、重复性较差等缺点，影响了结果的可信性。本实验采用PCR方法荧光定量检测HBV DNA，采用微粒酶免疫测定技术半定量检测HBsAg和HBeAg，明显提高了实验结果的可信度。 本实验结果表明：白背叶根在48．25mg/mI浓度以下，对Hep c2．2．15细胞毒性较低；在浓度为31．25，15．63，7．82，3．91，1．96、0．98 mg/ml时对Hep C2．2．15细胞分泌的HBV DNA仅有微弱抑制作用，而对分泌的HBsAg、HBeAg均有明显抑制作用．并随时间和浓度增强，Tl远大于是2，表明背叶根属有效低毒药物，是具有潜在的抗HBV开发前景的药物。 应用Hep G2．2．15细胞模型进行的药理学实验只能反映药物对Hep G2．2．15细胞HBV标志物的抑制作用，不能反应体内免疫系统的调节，若再结合体内抗HBV实验，将更有助于白背叶根抗HBV的药效评价。

(如果您认为转载内容侵犯了您的权益，请及时联系我们，本网站将在收到信息核实后24小时内删除相关内容。)