中药指纹图谱的研究进展

单义旻，辛宁 (广西中医学院药学院，广西南宁530001) 采用现代先进手段开展中药的质量评价，应全面反映中药的内在质量，而指纹图谱技术是当今国内外认可的反映中药及其新药内在质量的方法之一．它能为从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制订提供全方位的质量保证。国家食品药品监督管理局对注射剂用中药材、有效部位或中间体、注射剂指纹图谱制定的各项技术进行了要求，标志着酝酿己久的中药质量管理标准一一中药指纹图谱正式启动。笔者就中药指纹图谱研究现状及未来发展综述如下。 1 中药指纹图谱的定义及特点 1．1 定义 基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻0424008-2D) 通讯作者：辛宁，Tel：(0771)2162563，E-mail：ningx0603@126．com 国家食品药品监督管理局在《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中对原料药(中药材)指纹图谱的定义是：“中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该药材特性的共有峰的图谱”；中药注射液指纹图谱的定义是：“中药注射剂指纹图谱系指中药注射剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该注射剂特性的共有峰的图谱。根据以上定义，则所有中药的指纹图谱系指某种(或某产地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。 1．2 特点 ①通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地；②通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。中药指纹图谱有2个基本属性：整体性和模糊性。所谓整体性，是指要把所得指纹图谱作为一个整体进行评价，而不是孤立地看其中单个峰的有无、高低来判断药材或成药的质量；而模糊性是指个体样品本身就存在着差异，难以精确地进行测量，绝大多数的指纹图谱本身就存在着模糊性，不能保证所得的指纹图谱中每个峰都没有重叠，而且也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，只要能圈定图谱中关键部分就可对样品进行质量控制。 2 指纹图谱的建立方法及应用 2．1 光谱法 2．1．1 红外光谱(IR) 红外光谱是由分子的振动一转动能级跃迁产生，反映化合物的分子结构特征。IR本身具有良好的指纹性，所反映的是中药中混和成分的叠加。中药内各种化学成分(内在因素)只要质和量相对稳定，样品按统一的处理方法进行，则其红外光谱是相对稳定的，不受自身、外界因素(种质、地域、加工方法、贮存等)的影响．张氏等对雷公藤和昆明山海棠浸出物进行IR测定，采用误差反向传播学习算法(BP算法)进行分类，得到理想的结果。田氏等测定了60种植物药和15种矿物药的700张IR，初步建立起可对植物药和矿物药进行鉴别的中药材IR分析法。徐氏等以赤芍的IR为依据，采用主成分分析法对来自18个产地的赤芍进行了聚类分析，可将18个产地大致分为6类，结果发现，这一分类与地理位置和气候条件有一定的相关性，同一区域内赤芍的性能较为相似，可解释传统中医学对赤芍药材质量评价的经验，并用人工神经网络法预测了45个赤芍样本的产区。 2．1．2 紫外光谱(Uv) 中药紫外光谱特征的差异在一定程度上反映了中药化学成分的差异，常可用于正伪品的鉴别。但在中药亲缘关系相近而紫外光谱不易区别时，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。由于紫外光谱具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差、分辨率低，需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。张氏等对32种石斛进行了紫外光谱测定，采用主成分分析对中药石斛质量进行了研究，分类结果与植物形态学鉴定结果基本一致。王氏等运用主成分分析法(PCA)及非线性映射技术(NLM)对来源于全国各地的40份苦参药材质量进行了化学模式识别研究，结果与传统鉴定一致。近年来，UV多与高效液相色谱及质谱(MS)联用，为中药材或复方制剂的质量控制提供参考依据。余氏等采用HPLC／UV／MS法分别对刺五加药材水溶性和脂溶性成分进行指纹图谱研究，得到分离度和重现性均较好的刺五加药材HPLC／UV及HPLC／MS指纹图谱，并分别对水溶性成分指纹图谱中5个色谱峰和脂溶性成分指纹图谱中8个色谱峰进行了初步定性。张氏等通过研究脉络宁注射液(石斛、牛膝、玄参和金银花)的色谱指纹图谱，比较注射液与药材之间指纹图谱的想关性，为脉络宁注射液的指纹图谱质量控制提供了依据。 2．1．3 核磁共振(NMR) 通过选择适当的提取分离程序，获得植物中药代表性化学成分的总提取物是该理论的核心，将这种总提取物称为植物中药特征总提物(general characteristicextracts of tranditional Chinese herbal medicines．GCEsof 7CHMs)。植物中药特征总提取物的’H-NMR图谱易于解析和进一步深入研究。植物中药特征总提取物都有其特征的图谱，与植物品种间存在严格的对应关系，没有混淆的余地。非常适用于植物中药的品种鉴别和化学分类研究。秦氏等应用硅胶柱色谱法和结晶法分离特征化学成分，对单体化合物进行H—NMR研究，从而实现中药材1H-NMR指纹图的解析，运用该法对苦皮藤基源鉴定进行了研究。 2．2 色谱法 2．2．1 薄层色谱法(TLC) TLC操作简便、快速、经济，特别是对失去外形的中药材，如粉末、浸膏等制剂，更有其优越性。TLC的另一大优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，即较柱色谱多了色彩这一可比“参数”，并可进一步配合色谱扫描或数码处理得到不同层次轮廓图谱和相应的积分数据。尤其适，合日常分析检验和现场检验。颜氏等对黄连作了TLC指纹研究，发现商品黄连样品的7LC图谱中可检出包括微量生物碱在内的9—11个斑点。其荧光及紫外扫描轮廓图可作黄连药材的指纹图谱。林氏等对柴胡10个品种40个样品进行了TLC分析，结果显示，皂苷d、a、c为柴胡属植物的特征性成分，根据指纹图谱的差异可判断药材的品种。TLC又有不足之处，如效能低、灵敏度低等。 2．2．2 高效液相色谱法(HPLC) HPLC是现在应用最多的一类，具有分离效能高、精密度高、准确性好、分析速度快等优点。如运用二极管阵列检测器，可得到三维图谱，因而适用于成分比较复杂、紫外光区有吸收药物的分析。尤其对成分差别较细微的单味药材及成分较为复杂的复方制剂，其分离与鉴定能力大大优于同分离原理的TLC。张氏等通过高效液相色谱一二极管振列检测器(HPLC-DAD)得到的中药苦荞麦指纹图谱的最佳检测波长。洪氏等采用梯度洗脱技术对大黄样品的甲醇冷浸液进行分析，一次进样即能分离蒽醌苷与苷元，对3种正品大黄的9个样品进行了HPLC分析，归纳其指纹特征，而后与10个待区分样品的HPLC图谱进行分析比较，结果利用正品大黄的HPLC指纹特征很易区分非正品大黄，且与生药鉴定结果相符。黄氏等采用反相高效液相色谱法建立了进口棕榈科麒麟血竭和国产百合科剑叶血竭HPLC指纹图谱，并运用相对保留指纹谱方法，对获得的图谱进行数据化处理，得出重叠率、强峰、特征峰群和特征指纹峰检出率等参数，发现进口血竭和国产百合科剑叶血竭的HPLC指纹图谱差异明显，而同一品种不同产地的国产血竭指纹图谱极为相似，但主成分含量有一定差异。曾氏等利用液相色谱法分析芦根丙酮提取物，采用反相ODS柱，流动相为醋酸溶液：乙腈溶液=3：7(V：V)，检测波长为250 nm。根据相对保留值。和相对峰面积Sr建立了芦根的指纹图谱。周氏等采用Hypersil ODS(46 mm×250 mm，5 um)色谱分析柱，检测波长为360 nm，乙腈、异丙醇和o．49％枸橼酸为流动相，1 mL／min的流速梯度洗脱，对银杏叶片剂中银杏黄酮进行指纹图谱测定。并采用原国家药品监督管理局推荐的中药指纹图谱计算软件进行计算，建立了银杏叶片剂中银杏黄酮的共有指纹图谱。 2000年，国家食品药品监督管理局制定了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，对已批准的中药注射剂和申报的新中药注射剂实行药材和制剂的指纹图谱标准的要求，多数的中药注射剂都采用了HPLC方法来测定指纹图谱。 2．2．3 气相色谱法(GC) GC具有分离效能高、分离速度快等优点，所得的色谱轮廓重现性好，分辨率相对来说较好，由于是封闭系统色谱，外界影响因素较少，稳定性较好，检测设备可选性较大，特别适用于挥发性药材和制剂的指纹图谱的研究与应用。洪氏等对柴胡属植物挥发油的气相色谱指纹图谱进行研究，首次提出了各种色谱峰的相对保留值和相对峰面积的指纹图。GC-MS计算机联用技术的发展，已成为鉴别富含挥发油类药材的首选方法．凌氏等根据规范化的色谱条件测定了砂仁、当归、苍术、柴胡、藁本和香附等6种常用中药的挥发油成分的气相色谱保留指数，利用GC-MS和GC-F7IR(傅立叶变换红外光谱)对各主要成分作出了定性鉴别，对GC保留指数(GCRIs)用于中药材的鉴别进行了比较系统的可行性研究。钱氏等用GC建立了高良姜挥发油的指纹图谱，结果发现，道地药材及不同产地收集的市售商品具有相当稳定的、相似程度很高的指纹图谱，与混淆品有明显区别。 GC也被用于中药复方制剂的检测，如吴氏等对仲景胃灵片及其原料药小茴香、高良姜、肉桂、砂仁的石油醚提取部分进行了GC研究，获得了较为可靠的指纹特征谱图。魏氏采用GC-MS对醒神滴鼻液、脑醒滴鼻液、脑醒注射液进行了研究，发现单味成分在全方总离子流图中均可检出，以其出峰先后及相对含量为特征，构成了复方制剂的GC-MS指纹图谱。 2．2．4 高速逆流色谱(HSCCC) HSCCC是当前国际流行的新型的液一液分配技术。它具有很好的适应性，从理论上讲，HSCCC可以适用于任何极性范围样品的分离，所以在分离天然产物方面有其独到之处。它的分离度和重现性与HPLC基本相同，但它操作更为简便，容易掌握。对样品的预处理要求低，仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高，能实现梯度操作，亦能重复进样，在中药质量分析控制研究中尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。沈氏用HSCCC技术对多种中药进行了指纹谱分析都得到了较好效果。顾氏等用HSCCC分离纯化3个产地的丹参，各得到12个洗脱组分，经HPLC和Uv检测证明3张HSCCC洗脱图谱中对应洗脱峰为同一组分。HSCCC洗脱图谱不包含非共有峰，并且对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差RSD<3％，符合国家标准关于制订指纹图谱方法学考察资料的技术参数。说明HSCCC作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。 2．2．5 高效毛细管电泳(HPCE) HPCE具有分离模式多、分离效率高、速度快、适用范围广、所需样品量少和试剂量少等优点，将其运用于中药的指纹图谱的研究，已经取得可喜的成绩。利氏、王氏分别对HPCE法在药物分析中的应用进行了评述和展望，并对其与HPLC法进行了比较，肯定了其在中药指纹图谱研究中的应用。孙氏等以60％甲醇溶液提取，采用毛细管区带电泳法，建立了10批红花道地药材的指纹图谱。目前，毛细管电泳法已被用于中草药中生物碱、黄酮／黄酮苷、酚酸、香豆素、强心苷、皂苷、多肽、蛋白质等成分的分析。但是，与HPLC法相比，其最大的不足为重现性差。针对这点，谢氏等提出采用淌度比法、对照品校正法、保留指数法这3种方法来提高HPCE的重现性。许氏等C2“对不同产地狗脊及狗脊炮炙品中的多糖进行HPCE指纹图谱分析，结果不同产地狗脊所含多糖HPCE图谱基本一致，但经炮炙后的药材HPCE图谱有所改变。 2．2．6 色谱联用技术 由于中药复方制剂成分复杂，现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱，因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充信息，可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前，最常用的是高效液相谱(或毛细管电泳)一二极管阵列检测器一质谱一质谱联用方式(uPLC或CE-DAD-MS-MS)所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题，又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了一种新的解决途径。 2．3 分子生物学方法 DNA指纹图谱法(DNA fingerprinting)是建立在聚合酶链反应(PCR)技术基础上的一种分子标记技术。利用PCR从不同生物样品中人工合成DNA片段，而这种DNA片段的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为“DNA指纹图谱”。这种DNA指纹技术具有重复性好、灵敏度高的优点．由于DNA分子标记直接分析的是生物的基因型而非表现型，所以鉴别结果不受环境因素、样品形态(原品、粉状或片状)和材料来源的影响，因此，可为中药品种鉴别提供更加准确可靠的手段。DNA指纹图谱技术在鉴定名贵易混淆原药材、动物类原药材，以及鉴定近缘原药材品种方面有其独到优势。 目前，在原药材鉴定方面常用的DNA分子标记技术有限制性片段多态性(RFLP)、PCR、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等。但是这些技术的应用价值不同：RFLP是最常见的构建DNA指纹图谱的方法，但其技术多态性低．遗传信息有限，需要的DNA模板量大，且操作复杂。PCR技术能对微量或高度降解的DNA样品进行分析，尤适用干燥药材鉴别。AFLP具有多态性高、稳定性好的优点，但所需DNA模板量大，操作步骤复杂，同时它还是专利技术。RAPD技术具有简单易行、需DNA量少、易于自动化、实验周期短等优点，其缺点是反应条件较敏感，重复性差；但它可以在物质DNA序列尚不清楚的情况下检测DNA的多态性，因此在中药指纹图谱方面具有良好的应用前景。 曹氏等对不同来源苦地胆采用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)和RAPD技术所得到的同一品种DNA指纹图谱几乎一致说明PCR方法在中药品种鉴别上的稳定性和重现性。周氏等用RAPD技术对5个不同品种狼毒进行分析，得出了5种狼毒的RAPD扩增指纹图谱，具有鉴别意义。杨氏等用RAPD方法对正品和伪品大黄进行了指纹图谱的研究，为正品和伪品大黄的基原鉴定提供分子依据。 3 中药指纹图谱的解读 中药指纹图谱的两大特征是整体性和模糊性，因此，在分析处理中药指纹图谱时，只要抓住图谱中的关键部分就能对样品进行合理的质量评价。国家食品药品监督管理局颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中规定了指纹图谱的技术参数，包括共有指纹峰的标定、共有指纹峰面积的比值、非共有指纹峰面积等要求。指纹图谱的评价还可以用相似度(RSD)为指标，合格品的RSD要求在0．9—1．0之间，可用国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(CASE)”计算相似度。此外，苏氏等”“利用计算机采用模糊聚类分析法、反向传播人工神经网络计算机识别法、灰色关联聚类法，解析了黄芩TLC、苦丁茶HPLC指纹图谱、细辛GC-MS和x射线指纹图谱。 4 结语 美国FDA在植物药制品指导原则(征求意见用草案)中允许申报者提供产品色谱指纹图谱资料，英国草药典、加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会、印度草药典也接受色谱指纹图谱。我国国家食品药品监督管理局首先以建立中药注射剂指纹图谱为起点，逐步建立原药材、饮片、中成药的现代质量标准，从而能规范中药市场，保证用药安全、有效、可控、稳定，使中药走向国际市场。因此，为中药及制剂建立相应指纹图谱．不仅是时代发展的必然．也是我国中药走向世界的关键。

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