中药热毒清口服液对内毒素性发热家兔血浆白细胞介素一8和一氧化氮的影响

李雪苓 内毒素性发热由革兰阴性菌感染引起，临床治疗多采用抗生素。动物和临床实验均显示，抗生素能有效杀灭病菌，但由于病菌裂解又往往促进大量内毒素(LPs)释放人血。LPS可诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，从而导致多脏器功能失常综合征(MODS)。一氧化氮(No)和白细胞介素一8(IL一8)是体内重要的细胞因子，不仅参与机体的免疫调节及防御反应，还具有强烈的致炎活性，可介导LPS的毒性作用；NO和IL一8参与发热机制。目前尚无既能杀灭细菌又能中和内毒素的药物。临床实验研究证明，热毒清口服液具有抗病毒、抗菌、解热镇痛作用C2l。本课题旨在探讨热毒清口服液治疗家兔内毒素性发热的可能机制，以及药物作用强度最佳剂量，为临床治疗提供依据。 1 材料与方法 1．1 实验动物 选用家兔60只，体重1．8—2．3 kR，雌雄不拘，由安徽医科大学实验动物中心提供。 1．2 试剂与药品 大肠杆菌LPS由美国Sigma公司提供；IL一8放射免疫分析测定盒由北京北方生物技术研究所提供；NO测试盒由南京建成生物工程研究所提供；复方乙酰水杨酸片(APC)由西安利君制药股份有限公司提供；热毒清口服液(白蚤休、连翘、黄芩、板蓝根、大青叶、射干，每毫升含生药0．3g)由安徽中医学院第一附属医院提供。 1．3 分组与用药 (l)家兔发热模型的建立：家兔单笼饲养。自由饮水与摄食，室温18-20℃。随机分为APC组(A组)、热毒清口服液高剂量组(B组)、热毒清口服液中剂量组(C组)、热毒清口服液低剂量组(D组)、模型组(E组)、正常对照组(F组)。每组10只。将LPS用无菌生理盐水配制成100 ml中含25真μg的溶液，试验前置于38℃水中温浴，按o．25μg／kg于家兔耳静脉缓缓注射，造成家兔发热模型。正常对照组注射等量无菌生理盐水。(2)家兔给药方法：各组均灌胃给药，给药量根据实验动物与人体体表面积换算，A组给APC0．023g／kg，C组给热毒清口服液0．47ml／kg，B组按C组的2倍给药量，D组按C组的0．5倍给药量，E组和F组均予生理盐水lml／kg，各组均于注射In后2h给药1次。(3)测温方法：用MGA一Ⅲ219型电子测温仪，将测温仪探头插入家兔肛门内5cm记录直肠温度。(4)家兔标本采集：各组动物于试验前24h及注射LPS后2h抽取家兔耳中央动脉血，4℃低温分离血浆，分装冻存(一30℃)待查。 1．4 观察方法 (1)肛温：试验前测肛温3次，每半小时测1次，取平均值为基础体温，在注射EF后每小时测1次，连续测5h。(2)IL一8含量：采用放射免疫技术，测定血清IL一8含量。被检血清或lL一8标准与一定量的125IL一8及一定量的1L一8抗血清溶液混匀后4℃温育24h，而后加入免疫分离剂，与抗体的复合物则产生沉淀。离心分离，测定总放射性(T)。吸去上层清液，在测定沉淀的放射性(B)，计算各标准点的结合率(B／Bo％)，作出标准曲线，被检血清根据B／Bo％结合率可从标准曲线上查得其1L一8浓度。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。即采用夹心ELISA法。(3)NO含量：具体操作按试剂盒说明书进行。(4)BUN、CR：采用日立7060生化分析仪分析，具体按说明书进行。(5)急毒试验：由安徽中医学院药学系承担。 l．5 统计学处理 应用SPSSl3．0统计软件。计量资料以(云女s)表示，采用t检验。 2 结 果 2．1 各组家兔体温变化比较 见表1。实验前各组家兔体温相近，家兔经耳静脉注射内毒素后1h，体温即升高达峰值，造模成功，于4h开始下降，5h降至正常。各组家兔分别给予不同的处理，其中A组解热效应显著，B、C组于给药后2h发热反应减轻，与E组比较差异显著(P<0．05)，其维持作用时间持久，于给药后3h仍存在；D组未见明显减轻发热反应；A组与C组比较差异不明显(P>0．05)；4hD组体温高于B、C组(P0．05)。提示热毒清口服液高、中剂量组均有明显解热作用，其与APC组相比较退热作用相对起效较慢，但维持作用时间长；低剂量组解热作用不明显，高、中剂量组解热作用无明显差异。 2．2 各组家兔IL一8、NO一2／NO一3活性比较 见表2。家兔经耳静脉注射LPS后2h，E组lL一8、NO一2／NO一3显著升高(P<0．05)；B、C组未见显著升高(P>0．05)，与E组比较差异显著(P>o．05)；A、D组与E组相近(P>o．05)；B组与C组比较差异不明显(P>0．05)，A组高于B、C组(户0．05)，F组与B、C组比较差异不明显(P>0．01)，F组低于A、D组(P<0．05或0．01)。提示热毒清口服液具有减轻炎症反应、局部组织细胞及全身性损害作用。 2．3 各组症状与体征观察 E、D组耳静脉注射内毒素后0．5-1h开始发热，出现耸毛、颤抖、蜷缩、拒食、心率加快，1—2h后耸毛、颤抖、蜷缩逐渐消失，发热更加明显，心率加快，频繁饮水，胸腹灼热，睑结膜充血明显，舌质偏红，耳缘及皮下未见出血、斑点，精神萎软。4-5h后逐渐消失。A、B、C组上述症状较轻；F组未见上述表现。提示热毒清口服液能改善内毒素性发热家兔症状与体征。 2．4 急毒试验 各组均未发现明显不良反应。 3 讨 论 本课题所用方由蚤休散化裁而来，原方出自《药奁启秘》，由蚤休一味药组成，主治外科疔疮肿痛。鉴于外感高热为外邪入侵，人体正气与之相搏，正邪交争与体外，或热毒斥于人体而发热，即所谓“阳胜则热”的病理特点，故选蚤休、连翘、射干、黄芩、大青叶、板蓝根而组成是方。蚤休为君，味苦性寒，归肝经，清热解毒、消肿止痛、息风止痛；连翘为臣药，味苦性寒，归肺、胃、小 肠经，清热解毒、消痈散结；射干味苦性寒，归肺经清热解毒、祛痰利咽；黄芩味苦性寒，归肺、胆、脾、胃、大肠、小肠经，清热燥湿、泻火解毒、止血；大青叶、板蓝根味苦性寒，归心、胃经，清热解毒、凉血消斑、利咽作用。全方解毒退热、利咽止痛具有抗病毒、抗菌、解热镇痛作用。 药理研究证明，本方各成分均有抗病原微生物与抗炎退热作用，其中蚤休有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、溶血性球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等均有不同程度的抑制作用；连翘抗菌的主要成分为连翘酚及挥发油，对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，对其他致病菌、流感病毒及钩端螺旋体也均有一定抑制作用，可解热、抗炎；大青叶对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌均有一定抑制作用；板蓝根对多种革兰阳性菌、阴性菌及流感病毒可增强免疫功能，有明显的解热效果；黄芩煎剂对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等均有不同程度的抑制作用，有解热、镇静、降压作用；射干对外感及咽喉疾患中的某些病 毒有抑制作用，有抗炎、解热及止痛作用。 研究表明，LPS可刺激单核巨噬细胞而造成多种细胞因子的过多产生，特别是诱发与炎性反应密切的肿瘤坏死因子一。(TNF—α)、白细胞介素一6(lL一6)、白细胞介素一8(IL一8)等持 续或过量释放，引起机体多炎症细胞活化及凝血系统、补体系统 激活、毒性产物及炎症介质连锁释放，是造成过度炎症反应、局 部组织细胞及全身性损害的重要原因。 IL一8主要由单核细胞、组织巨噬细胞、PMN、血管内皮细胞在LPS等刺激下产生，是目前已知最强的PMN趋化和激活因子。IL一8能诱导细胞变形反应、脱颗粒反应、呼吸爆发及释放蛋白酶、溶酶体酶类和氧自由基，促进内皮或非内皮源性左旋精氨酸／一氧化氮(L—Arg／NO)途径刺激NO产生。HL一8介导lL一1、TNF等在体内的炎症效应，能引起与内毒素血症、感染性休克类似的病理生理反应．其参与DIC发生的可能机制为趋化和过度激活粒细胞，释放大量毒性产物及炎症介质，激活凝血、纤溶、激肤系统，最终导致内皮损伤及微血管血栓形成。 NO主要由NO合成酶催化L—Arg产生，是内皮细胞衍生的重要舒血管物质，几乎参与各种疾病过程。近年来，NO在LPS诱导的疾病中作用引起了人们的重视。在体外NO可促进LPS调控中性粒细胞释放了NF的作用。NO在败血症、感染性休克发病机制中的作用十分引人注目。单核／巨噬细胞的诱导型NO合成酶(iNOS)在LPS和了NF、IL一1等细胞因子刺激下，持续大量产生NO，可导致血管持续舒张，血压降低，组织灌注异常，乃至休克，并可损伤血管内皮细胞，导致DIC发生。 本实验发现，内毒素性发热家兔模型中循环血IL一8、NO一2／NO一3水平均较正常对照组显著升高，表明二者协同参内毒素性发热机制。热毒清口服液中剂量及高剂量组IL一8、NO一2／NO一3水平均未见明显升高，与模型组比较有显著性差异，热毒清口服液低剂量组、APC组无抑制其升高作用，提示热毒清口服液中剂量及高剂量组可抑制IL一8、NO一2／NO一3的升高。热毒清口服液中剂量及高剂量组均有明显解热作用，其与APC组相比较，其退热作用相对起效较慢，但维持作用时间较长，低剂量组无明显解热作用，热毒清口服液中剂量及高剂量组相比较其解热作用无明显差异。实验中热毒清口服液各组治疗前后 肝肾功能无明显异常变化，急毒试验均未发现明显毒副作用。结果表明，热毒清口服液中剂量组为最佳治疗剂量，因而为临床筛选最佳治疗剂量提供了理论依据。同时热毒清口服液能改善内毒素性发热家兔症状与体征，表明热毒清口服液不仅有消炎、杀菌和解热的功能，以减轻炎症反应、局部组织细胞及全身性损害，而且还具有清除LPS的作用，其部分机理可能通过调控细胞因子网络而实现的。

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