活血化瘀中药对实验性急性脑梗死大鼠脑组织VEGF、bFGF mRNA表达的影响

宗慧梅 王 禹 1 材料与方法 1．1 动物与分组 Wistar大鼠(辽宁中医学院实验动物中心提供)120只，雌雄各半，体重(250±30)g，适应性喂养4d，随机分为十组(各12只)，即假手术组，2-6h、5-2h、8-72h模型组，3-6h、6-24h、9-72h对照组，4-6h、7-24h、10-72h治疗组。 1．2 大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型制作 遵照Koizumi等方法及加以改进的动脉线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌注模型。大鼠腹腔内注射10％水合氯醛(300mg／kg)麻醉后，仰卧固定于手术台上，取颈部右侧旁正中切口，剪开浅筋膜，显露右侧胸锁乳突肌。顿性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露右侧颈总动脉(CCA)和迷走神经。顿性分离CCA，结扎近心端，注意避免损伤迷走神经。分离右侧颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎ECA近端。分离ICA至颅底，并找出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉(PPA)。用微动脉夹夹住ICA，在CCA近颈内、颈外分叉处剪一小口，将尼龙线(直径0．3mm)顺势缓慢送人，将线栓与CCA结扎固定，松开夹住ICA的微动脉夹，线栓插入深度约为(1．8士0．1)cm，将大脑中动脉起始端血流阻断。剪除线栓多余末端，在ICA根部结扎固定，以防止其内的线栓移动，无明显出血后，消毒缝合皮肤，放回笼中，自由喂养。假手术组只分离CCA及ECA，不插入尼龙线；其余九组则插入尼龙线造模。选择苏醒后行走向左旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为栓堵失败而弃之不用。 1．3 给药方法 术后立即给药(按人鼠等效剂量换算给药量)：各模型组每日用生理盐水(3m1)灌胃；各治疗组给予力升活血胶囊(生水蛭、生大黄、川芎)5mg／lOOg，每日1次灌胃；各对照组给予脑络通胶囊(广州光华股份有限公司提供)8mg／lOOg，每日1次灌胃；假手术组自由摄食，饮水。并按再灌注不同时间即6、24、72h三个时间点采集标本。 1．4 逆转录PCR(R了一PCR)法检测VEGF mRNA和bFGFmRNA表达水平 每组随机抽取大鼠3只，根据SABC总RNA提取系统(大连宝生物工程有限公司提供)所述的步骤和方法提取患侧脑组织中总RNA。用核酸蛋白分析仪测OD值，以确定样本中无蛋白残余。总RNA(1p．g／p,1)浓度：OD260 x40 x稀释倍数／1000，并取上述备用样品用于反转录。按说明(大连宝生物工程有限公司提供)配制反转录反应液，引物序列由大连宝生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下，VEGF：P1：5’一GCTCTCTTGGGTGCACTGGA - 3' ; P2 : 5' - CACCGCCTTGGCTTGTCACA - 3' ;PCR 产物为 563bpo bFGP: PI : 5' - AAGCGGCTCTACTGCAAG - 3' ; P2 : 5' - CAGGCCCCGrlTITGGATCCG - 3' ;PCR 产物为 336bp。 beta - actin: P1 : 5' - CATCTCT"T' GCTC-GAAGTCCA - 3' ; P2 : 5' - ATCATGTTTGAGACCTTCAACA - 3' ;PCR产物为700bp。并按操作规程进行逆转录(RT)，聚合酶链反应(PCR)，琼脂糖凝胶电泳，最后完成照相和分析。 l．5 统计学处理 计量资料以(X±s)表示，应用SPSSll．5软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法。 2 结 果 2．1 各组实验大鼠脑组织VEGF的RT—PCR测定 见图1。表1。结果示假手术组脑组织VEGF mRNA表达最高，模型组脑组织VEGF mRNA在再灌注6h时接近正常组水平并开始降低，24h时显著降低，72h时有所升高，但仍低于正常组及治疗组水平。各治疗组6h时脑组织VEGF mRNA表达降低，但接近假手术组和模型组水平；24h时显著降低，但高于同期模型组、对照组水平；72h时表达高于同期模型组和对照组水平，低于并接近正常表达水平。对照组表达趋势同治疗组，但有所下降。 2．2 各组大鼠脑组织VEGF／B—actin密度值的比较 见图2。 2．3 各组大鼠脑组织bFGF的RT—PCR测定结果比较 见图3，表2。结果示正常脑组织仅有少量的bFGF mRNA表达，模型组脑组织bFGF mRNA表达在6h时表达较假手术组显著上调，24h继续上调，72h时表达下调，接近对照组水平，低于治疗组水平。各治疗组脑组织bFGF mRNA表达变化与模型组相同，24hbFGF mRNA的表达较模型组升高，72h仍高于模型组和对照组；对照组其变化同治疗组，但有所下降。 3 讨 论 VEGF和bFGF在生理性血管生成过程中是主要的刺激因子，对新生血管具有上调作用13l。Wilting等观察VEGF和bFGF对CAM的效应时发现，两者都能刺激血管增生。本实验通过线栓法制备大鼠急性脑缺血模型，通过给予活血化瘀、泻下通腑中药，观察活血化瘀中药对大鼠急性脑缺血脑组织VEGF mRNA和bFGF mRNA表达的影响，进一步阐明了活血化瘀、泻下通腑中药能够上调VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达，从而促进新生血管的生成，促进侧支循环的建立，而改善脑供血。 脑梗死早期损害的根本原因是脑组织的缺血缺氧，本实验证明在脑梗死的早期VEGF mRNA的表达下降，bFGF mRNA的表达上升；活血化瘀中药能够上调VEGF mRNA、bFGF mRNA的表达。同时，实验显示，VEGF mRNA表达在脑缺血早期(6-72h)的表达低于正常水平，活血化瘀中药的干预虽然能改善这种情况，只是使其表达接近正常。这一点正好与临床脑梗死后，新生血管的生成、侧支循环的建立主要在第14日左右的情况相吻合。总之，本实验证明活血化瘀、泻下通腑中药在缺血早期能够匕调VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达，促进新生血管的生成，促进侧支循环的建立，而改善脑供血。因而活血化瘀、泻下通腑中药早期治疗脑梗死是必要的。

(如果您认为转载内容侵犯了您的权益，请及时联系我们，本网站将在收到信息核实后24小时内删除相关内容。)