基因芯片技术在中医药研究中的应用探讨

郭书文，孟庆刚，王国华，卢建秋，刘珍清，盛瑞生，崔巍(1．北京中医药大学北京100029；2．大同大学，山西大同037008) 随着人类基因组计划研究的推进，一些基因芯片技术陆续迅速形成，近年已广泛应用于医学各学科中。如在特异性相关基因克隆、基因功能研究以及疾病的诊断、治疗、药物研究等均发挥着重要的作用。目前，基因芯片技术在中医药研究中虽然仍处于摸索阶段，其理论和方法尚未成熟，但其高通量、自动、快捷、准确、多态性及可重复性等优点，可望对传统中医药学证的研究、复杂的作用机理研究、有效药物筛选及中药新药研发等，提供可行的手段和方法。 1 从基因分子水平研究中医“证” 功能态失常的病理表现是中医证的主要特征。在疾病发生发展过程中，证的表现具有相对稳定性，但临床所见往往不是单一的，更有复合或动态易变特性，因此，认识和把握证的实质较为困难。那么，在从事证的研究中不能简单地将症状集合作为证候诊断的依据，需考虑证形成过程中的综合影响因素，进而确定证因素的贡献度。利用基因芯片的多态性表达技术，对用传统方法诊断准确的证进行证的基因表达相关谱的建立，推断表达谱基因的相互关系，揭示基因与证的实质联系，或许对证的病理生理改变会有一个较清楚的认识，可能从基因分子水平揭示证的本质。目前，基因芯片技术与证的相关研究亦有报道，有以寒证基因芯片数据库为基础提出用纵向发展的聚类分析、横向互比的聚类分析、分证候的聚类分析、合寒证的聚类分析进行研究，并考虑了寒证单证候的疗效对比，寒证证候变量主导因素及其与主效基因组的相互关系等，但仅是提出的前瞻性的研究方法，仍在探索之中。刘氏在胃癌证候分析的基础上，对原发性胃癌患者的胃癌组织进行了表达谱研究，发现热毒内蕴兼气虚者表达差异的基因有71条，上调者35条，下调者36条；气虚兼瘀血者表达有异常的基因96条，上调57条，下调39条。有学者利用高通量、平行检测的基因芯片技术对系统性红斑狼疮患者基因差异表达进行了分析，共发现了16大类580条基因有显著表达，其中大部分基因特别是与代谢相关的基因表达与热毒炽盛型和阴虚内热型有一致性，但对证型的基因鉴定未作探讨。这些均说明了基因表达差异与证候是有关联的，但是，揭示证本质的基因表达尚未确定。此外，尚有就基因芯片技术在血瘀证和活血化瘀研究中的应用、采用基因芯片技术开展体质学即寒体和热体与能量代谢基因表达的关系、虚寒证的基因组研究等进行了阐述，但所述内容多局限于研究思路和拟采用的方法学上。随着该技术的不断成熟，可望为中医“证”这一棘手课题的研究提供手段。 2可用于中医动物模型的研究 在中医药现代化研究中，建立能够揭示中医基本科学问题、重现性较好、用于中药新药研制开发的中医动物模型是一项非常重要的工作。理论上讲，中医证候动物模型的研究应该是能体现中医辨证论治特色的一种较理想的方法，但随着数十年来研究的深入，其存在的问题也逐渐显露。如：①传统病因的选择与实施强度不易控制；②客观指标的特异性、重现性等较差；③证候的信息特征难以在动物身上收集，从而缺乏对模型动物的辨证诊断及模型构建评价体系；④模型缺乏重复应用性，对中药新药药理研究发挥不出应有的作用，证的动物模型的研究长期停留于造模阶段，致使中药新药药理实验研究仍在借用于西医的病理模型；此外，有病证脱节、功能与物质结构脱节等问题。随着大鼠、小鼠、兔、狗等动物基因组测序的完成，将会研制出实用的基因组芯片。在人体证候规范化的基础上，借助西医的病理模型，采用功能指标与功能相关的物质指标相结合、定性与定量或半定量相结合方法，利用基因芯片技术从整体、器官、细胞等水平筛选有关基因的差异表达，获取并归纳与证候相关的关键特征信息，选择功效相对稳定的不同类标准方药，进行证属性排比性的药物佐证，进而确定该证的基因表达谱情况，从而建立相应的中医证模型和评价体系。有学者应用基因芯片技术研究利血平脾虚证大鼠模型大脑皮层基因表达谱的变化，在筛选的4096条靶基因中，脾虚证模型基因差异表达一致的基因145条，占检测基因的3．54％，说明脾虚证实质涉及大、脑皮层的基因表达谱改变。这些均是有意义的初步研究。 3在中药复方研究中的应用 由于中药复方作用的复杂性，目前尚没有一种准确的方法能清楚地阐明中药复方的作用机理。近年来，高通量基因芯片的发展，能同时检测出大量信息，为中药复方研究提供了新的思路和方法。周氏等利用基因芯片技术检测了黄连解毒汤及其成分黄芩苷、盐酸小檗碱对用细菌脂多糖造模的小鼠脾细胞基因表达的影响，提示复方的作用明显优于有效成分的作用，但对具体基因表达影响的分析存在一定难度。有利用基因芯片技术研究局灶性硬化肾小球肾炎模型小鼠的细胞因子表达谱以及复方积雪草的调控作用，提示积雪草具有抗肾纤维化作用，其作用效应可能是多种细胞因子共同调控的结果。王氏研究证实，益气化瘀方对大鼠退变颈椎问盘细胞内信号和传递蛋白类基因表达有影响的6条，其中上调的有4条。李氏研究提示中药复方能改善狼疮小鼠肾脏病变，调节肾组织多个系统的基因表达，纠正Th1／Th2细胞因子的比例失衡。可见基因芯片技术可以用于中药复方作用机理的研究，特别是其高通量有助于解决中药作用多靶点的棘手问题。可是，上述报道多局限于对疾病基因的影响，况且目前这些异常的基因表达谱并不一定有特异性，其对疾病的诊断价值仍在探索和研究之中。同时，信息的分析与鉴别亦是一个棘手问题，虽然有学者探讨了聚类分析方法在自身免疫系统疾病基因表达谱研究中的应用，提示聚类分析能根据基因表达谱将基因进行功能分类，可用于基因表达谱数据的分析。但如何正确分析所获取的大量信息，凝炼出相关有价值的信息，仍需大力研究，尤其在中医药研究中相关数据的分析应更加重视。孟氏等在中医药研究中提出信息的非线性处理模式，并将在统计分析处理过程中可能涉入的误区作了系统论述，为该类研究的分析提供了可借鉴的思维和方法。 4基因芯片技术在中药研究中的应用 通过长期临床实践证实，中药的疗效是肯定的。但是，由于中药是多种成分的混合制剂，其功效与西药相比具有多效性、复杂性、相对不稳定性和双向调节性等；同时，中药的药理作用还具有多途径、多靶点的特点。所以，利用现代技术如何建立中药研究的技术平台，来进行中药疗效评价、筛选中药新药及其代谢与毒副作用的评价方面具有重要的意义。利用基因芯片技术或许能够解决一些技术难点。 4．1有效中药的筛选 国内外学者已逐渐将基因芯片技术运用到药学研究中。现代药理学研究已明确药物作用都有其靶基因，靶基因是药物作用的最本质的指标。目前，国内外许多制药公司或相关研究机构已建立或正在建立基因芯片表达谱数据库，为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这些可为有效中药或中药有效成分的筛选提供思路和研究方法，但由于中药的有效成分十分复杂，且中药的临床作用有特定的中医理论作指导，所以中药的筛选还不能单纯地利用筛选西药的方法。有学者提出一种可以体现中药特点的新药筛选方法—现代中药新药筛选系统。该系统可在基因表达水平上更快速、更准确、更为可行地进行中药单、复方之间的配伍、中药各组分之间的配伍筛选，大大缩短新药研究的周期。该筛选方法虽不是发现中药新药的唯一途径，但对创新药物来讲，筛选是必不可少的手段和途径。目前，肿瘤中草药筛选和开发是研究的热点领域，有学者利用微巨阵基因芯片在抗肿瘤血管生成中草药相关基因筛选中r得出结论，利用基因芯片技术可从基因水平解释中药的作用机制，为新药的开发提供理论依据。利用基因芯片技术筛选中药的目的是在基因分子水平上确定药物作用的靶目标，进而找出特效治疗作用的药物。可在不同基因及其表达的蛋白上添加所用的中草药，观测中药对基因和蛋白类表达的影响，从而进行归纳分析，了解其作用机制。同时，由于高通量的基因芯片，可以克服药物作用的单一靶点研究，有助于中药多方面作用机理的揭示，并有助于发现中药的新功能，开发另一类新药。 4．2基因芯片技术可用于中药的毒性评价 由于中药的作用机理是复杂的，在传统意义上讲是通过调节机体的整体功能而起治疗作用。利用传统药理毒理研究方法，对中药从整体、器官、细胞乃至分子水平很难进行较全面的评价。在中药提取物作用于动物的前后阶段，利用基因芯片技术将动物特定的细胞中相关功能基因表达差异变化进行对比，或许能够了解该中药在研究剂量下是否有细胞毒及产生毒性的作用。有学者认为，如果借助现代基因表达谱检测技术研究中药的肝脏细胞毒性，就能在基因转录表达水平上进行准确、快速、高效的筛选与安全性评价，使得能在分子水平上了解肝脏细胞毒性的作用靶点及方式、代谢途径。可见，这方面的思路和研究方法对阐明中药的作用机制和中药毒性的评价等有重要意义，可为推动中药研究的国际化进程，找出有说服力的“共同语言”。 4．3基因芯片技术用于中药鉴定的研究 能够准确地鉴定中药是保证中医临床用药安全有效、可持续发展的前提。我们常依据药物的来源、性状、形态学及理化性质，从形态特征、组织细胞特征及化学成分等方面进行鉴定，但各有局限性，特别是对中药复方制剂中用药组份的鉴别更是如此，因而难于满足中药鉴别的需要。有学者提出利用生物芯片技术可进行中药的基因识别研究。如应用基因芯片技术可实现中药品种快速、准确、自动化鉴定，有利于用药的安全与有效性；同时，由于某些原因造成道地药材与非道地药材品种的差异，但差别往往不是很明显，给道地药材的鉴别带来困难。应用基因芯片技术可望解决这一难题：此外，应用该技术或许可进行复方制剂质量的标准化研究等。 总之，基因芯片技术虽然还处于探索研究阶段，仍存在一些技术上的问题，但其在基因表达谱分析、基因诊断与治疗、药物筛选及序列分析等方面已显示出重要的价值。随着基因芯片技术研究的不断深入和完善，并注重结合其他医学生物学技术，将在中医药领域中证的研究、有效中药及中药有效成分的筛选、新药的研发等方面发挥重要的作用。中医药信息杂志

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