蝎毒的采集、提取、分离、鉴定研究

蝎毒是一类由数种多肽构成的具有生物活性的毒素，每种多肽由20～80个氨基酸组成，分为昆虫毒素和哺乳动物毒素，已分离纯化出多种哺乳动物神经毒素，且有商品销售。近代研究表明蝎毒有广泛的生理、药理活性，而且不同结构的蝎毒往往具有不同的生理、药理作用。有关蝎毒的采集、提取、分离、鉴定、生理、生化、药理等方面的研究已有许多报道，这对蝎毒的进一步研究和开发有着十分重要的参考价值，现将蝎毒的采集、提取、分离、鉴定的研究概况综述如下。 1采集与提取 1．1 采集 常用方法有剪尾提毒法、机械刺激采毒法、电刺激采集法。烟台市福山蝎毒粉厂采用电刺激采集法采集新鲜毒液，经高速离心分离，真空干燥制成不同等级的蝎毒粉，为蝎毒制剂生产提供原料。为保持蝎毒中酶的活性，可用置于冰浴中的试管收集，制得的蝎毒为灰白色粉末，需在干燥、遮光、低温下保存。蝎毒是从全蝎活体上利用适当的方法采集，为了保持其生物活性，大多用真空干燥或冷冻干燥的方法制成干毒。三种采毒方法相比，剪尾提毒法简便、快速、收毒率高，适于大批量采集蝎毒；缺点是活蝎只能供一次采毒，但后两种方法均可用于活蝎连续采毒，但采毒速度较慢。 1．2提取以蝎毒蛋白的含量为指标，用紫外分光光度法测定其含量，研究全蝎水煎煮、乙醇回流两种不同的提取工艺，通过正交设计法进行提取工艺条件的筛选，并确定各自最佳工艺条件：若水提则最佳工艺条件为每次用8倍量的水，煮沸时间为45min，反复提取3次：若醇提则其最佳工艺条件为每次用4倍量50％的乙醇回流提取30min，反复提取 3次。两种工艺比较：结果显示醇提优于水提。 2蝎毒组分的分离纯化 2．1 东亚钳蝎的分离纯化 2．1．1 神经毒素的分离纯化周新华将辽宁产东亚钳蝎用 CM—Sephadex C-50进行了离子交换层析，上柱量50mg，共得到12个组分。将毒性较强的第Ⅷ组分透析后再用重层析，又得到4个组分，再用SephadexG- 50凝胶过滤，纯化出两种毒素I、Ⅱ。为了得到更多组分，周新华等又用2g蝎毒一次上样，先用CM-Sephadex C-50离子交换层析分离，再用 Sephadex G-50过滤，最终纯化了9种毒素。吉永华等首次直接采用RP-HPLC对东亚钳蝎的粗毒进行分离，并且用两种不同的HPLC系统反复分离，用0．1％三氯醋酸一水和 0．1％三氯醋酸一70％乙醇一水进行梯度洗脱，获得了4个昆虫毒素，经聚丙稀酰胺凝胶板状电泳鉴定为一条带，且均为碱性蛋白。周新华等采用CM-Sephadex C-50、Sp-Sephadex C-25离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶过滤三步分离程序，从东亚钳蝎毒中得到一种新的哺乳动物毒素；蝎毒素Ⅲ。经低pH系统连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶板电泳及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定说明，该毒素为电泳纯蛋白质。李宏民用Sephadex G-50柱层析法将常德产的蝎毒粗毒进行分离，用0．05tool·L-1NH4HC03(pH8．0)洗脱，取峰3进行 Sephadex C-25分离，再用pH 6．0，0．Imol·L-1的磷酸缓冲液洗脱，分离出蝎神经毒素(BmK5)，HPLC分析有三个峰，用制备型等电聚焦技术再次纯化，取含量最多的第二峰(BmK 5-2)经HPLC分析即为单峰。 2．1．2离子通道毒素的分离纯化杨世杰等对蝎毒进行了二级提取，即用CM-Sephadex C-50离子交换层析提取得到Ⅷ峰，再用凝胶过滤得第二峰，经CM-Sephadex C-10除盐后的提取物Ⅷ一2具有单纯阻滞钠通道的作用。Lebran等从东亚钳蝎中纯化了3种新型毒素，分子量在3800～4300之间，含37个氨基酸残基，其均具有钾通道阻断作用_5 J。王琳等用CM—Sephadex C-50离子交换层析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析，从东亚钳蝎蝎毒干粉中首次得到1个分子量为26 625的蝎毒蛋白组分I， SDS-PAGE电泳显示为一条带，激光扫描纯度为94％，利用 SDS-PAGE电泳测定了其分子量，利用Lowry法测定其收率为2．06％，己被证明具有钠离子通道的阻滞作用。由此可见东亚钳蝎有望成为一种新型的研究钠、钾离子通道的有利工具。 2．1．3 蝎毒透明质酸酶的分离纯化 周新华等用CM-Sephadex C-50．CM-Sephadex C-25和Sephadex G-75凝胶过滤，从东亚钳蝎毒中提得纯蝎毒透明质酸酶，用低pH系统不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳鉴定均为单一条带，PAS染色证实为糖蛋白。贾琴堂等利用醋酸纤维膜电泳技术，在pH 8．6、 O．05mol·L-1巴比妥一巴比妥钠缓冲液中，电流强度为 O．6mA／cm，电泳时间为90min与电流强度为0．8mA／cm、电泳时间为60min条件下分离蝎毒蛋白组分，可获得15条电泳带：阴极端5条，阳极端9条，点样处1条。 2．2马氏钳蝎毒素的分离纯化 2．2．1哺乳动物神经毒素的分离纯化吉永华等对马氏钳蝎毒素用CM-Sephadex C-50柱层析分离，用0．01mol。L-1 NH4HC03溶液分5级洗脱，共分出13个峰，用DEAE—Sephadex A-50柱层析将毒性较强的Ⅺ峰分为两个峰，将Ⅺ一l峰和Ⅻ峰再次纯化，得到两个组分均为电泳纯，分别命名为马氏钳蝎神经毒素I和Ⅱ。 2．2．2昆虫神经毒素的分离纯化 吴宫、吉永华运用凝胶过滤、离子交换和反相高压液相层析等技术从马氏钳蝎粗毒中分离纯化得到一个新的毒素多肽(昆虫a型毒素)，采用电喷雾电离质谱仪测定了分子量(7180u)，采用氨基酸分析仪测定了氨基。 2．2．3膜毒素的分离纯化王锦兰等用山东产马氏蝎粗毒为材料，经Sephadex G-50和Sp-Sephadex C-25 2次柱层析，分离纯化获得3个毒峰部分，毒性比粗毒分别提高了40～ 100倍。纯度鉴别表明三个毒峰的聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳均为一条带。 2．2．4离子通道毒素的分离纯化 马氏粗蝎毒经Sephadex G-50超细凝胶柱层析，共分得4个流分。流分Ⅳ经阳离子交换树脂MonoS柱FPLC层析，共分得13个组分，组分1经再次FPLC层析后，HPLC柱(C18反相硅胶柱)纯化，最终得 BmK4112单体。 2．3澳州蝎毒素的分离纯化 分离的澳洲蝎毒素I、Ⅱ、Ⅲ的集样及个样进行含量测定，证明蝎毒在个体水平上具有多形化特点，并引用血清治疗学理论解释其实验结果。 2．4中亚蝎毒素的分离纯化从中亚蝎毒中分得3种对小鼠具有麻痹作用的多肽神经毒素M9、Mlo、M14，并测定它们的氨基酸组成。毒素M9、M14用胰蛋白酶、糜蛋白酶和金黄色葡萄球菌蛋白酶进行消化，并用BNPS-甲基吲哚断裂，阐明M9含66个氨基酸和M14含47个氨基酸的完整顺序。 2．5摩洛哥蝎毒素的分离纯化 将摩洛哥蝎B occitanus mardochei毒素进行凝胶过滤和离子交换交换等层析分析，得到7种蛋白质，其中6种可使小鼠致死。 2 .6生物活性组分的分离纯化 2．6．1 蝎毒抗癌多肽(APBMV)类组分的分离纯化 蝎毒抗癌多肽是河南医科大学生物毒素中心利用分子筛层析技术，从东亚钳蝎粗蝎毒中分离出的抗肿瘤的有效部位。孔天翰等对APBMV用HPLC进行检测发现有4个峰，说明 APBMV不是一个单一组分的多肽。郭进武等对APB—MV用Sepharose FF强阳性离子交换凝胶，通过改变柱长和流速，可得到不同的蝎毒样品，研究表明流速为1．0或 0．8mL／min-1是最佳的分离条件。孔天翰等将蝎毒预处理后，分别采用Sephadex FF阳性离子交换凝胶柱层析法和 Sepharose FF阳性离子交换凝胶柱与Sephadex G-50凝胶柱联合层析法，从APBMV中分离出AP一Ⅲ，并用HPLC检测纯度及产量，后者的分离效果比前者的效果好，其产率为 4．72％，纯度为95％。孔天翰等采用Sepharose FF阳性离子交换凝胶柱进一步分离APBMV可望获得较高纯度的单一有效成分，而利用HPCE及HPLC可较好显示蝎毒中小分子多肽的组成及相对含量，其结果基本一致。张振中等采用液相色谱／电喷雾离子化质谱法(LC／ESIMS)，对蝎毒二级提取物进行了分离纯化，结果表明此方法分离效果好，分子量定量准确。 2．6．2镇痛活性肽(SAP)类组分的分离纯化王起振等运用凝胶过滤和离子交换层析从东亚钳蝎粗毒中分离出SAP， SAP经PAGE得单一条带，HPLC层析为单一峰，镇痛作用研究表明SAP对大鼠及小鼠的内脏痛和躯体痛均有较强的阵痛活性，为有效利用蝎毒资源寻找新的镇痛药开辟了一个途径。孔天翰等改进传统两步柱层析法，采用一步柱层析法，利用CM-Sephadex C-50超长柱(长180cm，内径 4．5cm)一次成功地从粗毒中分离纯化了镇痛活性肽SV—IV，其镇痛作用强于吗啡，又无成瘾性。若能分离出更纯的镇痛活性肽成分或单体，将是一种很有潜力及应用价值的新型镇痛药。 2．6．3抗癫痫肽(AEP)类组分的分离纯化 于家琨等用柱层析法从东亚钳蝎毒蝎毒中纯化得到AEP。AEP是一种具有较强抗癫痫活性且热稳定性好的多肽，但口服易被酶水解、破坏，因此一般采用注射给药；现已有将其制成脂质体前体，同时加入高分子，保护其活性不被胃肠道中的酶破坏，并能很好吸收，为此类生化药物非注射给药提供了依据。 2．6．4 纤溶活性肽类组分的分离纯化 吕欣然等用CM—Sephadex C-50进行离子交换层析，透析脱盐后得到纤溶活性较强的多肽组分。实验发现分离成分有明显激活纤溶系统的作用。 3蝎毒的鉴定 3．1蝎毒的定性张景海等用Glaspac Column TSK G3000 SW胶过滤、离子交换高效液相色谱分离我国不同地区东亚钳蝎毒种类及含量。实验结果表明：利用HPLC法分离蝎毒，可以代替聚丙酰胺凝胶电泳来鉴定东亚蝎毒的产地。孔天翰等采用高效反相液相色谱法观察来源于钳蝎科中不同亚科及属的7种蝎毒的蛋白／多肽图谱，通过比较蝎毒问的差异，对制定相应质量标准有着重要意义。陈蕴等采用HPLC法获得了蝎毒的指纹图谱，并测定了可影响蝎毒质量的蝎淋巴液和可能用于掺伪的3种蛇毒的图谱，这为蝎毒及其制剂的进一步开发应用提供有价值的实验依据，研究10种蝎神经毒的图谱，以了解蝎毒在溶液中的相对构象，毒素CD谱个体间的相似性，与它们顺序相似程度及药理特异性有关，因此构象平衡可能是毒素进化和靶组织识别的重要因素。张振中等利用液相色谱／电喷雾离子化质谱法 (LC／ESIMS)对蝎毒二级提取物有效成分及分子量进行了分析，从蝎毒二级提取物的HPLC色谱图中有22个峰，提取各组分的总离子流图的质谱图进行结果分析，可以对蝎毒进行定性。动物类药材由于成分复杂，特别是经储存一定时间后，其蛋白质变性较严重，普通电泳鉴定较困难，利用 HPCE法具有速度快、分辨力强、重现性好等特点。张宗显等利用双向琼脂扩散法进行蝎毒素鉴别实验，经加样、染色后发现含蝎毒的琼脂板上出现清晰的免疫扩散图谱。 3．2蝎毒的定量 张宗显等利用LOWRY法测定了蝎毒中蛋白质的含量。可利用蛋白质抗原的特异性和抗体的高度选择性原理，利用抗蝎毒血清与被检测样品稀释液、对照蝎毒稀释液之间有无沉淀来测定蝎毒的含量。 4结语 蝎毒以其可靠的药理作用，在国际国内市场上供不应求，因此近年来国内外对蝎毒的研究发展很快，蝎毒毒性成分、活性成分的临床应用市场极大，本文旨在抛砖引玉，以期加快对蝎毒进行深层次的研究、开发和利用，制成高效低毒的新剂型，如脑靶向制剂、结肠靶向制剂等，更好地服务于患者，造福于人类。

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