现代分析技术在中药指纹图谱研究中的应用

中药作为中华民族的瑰宝，以其丰富的资源，独特的疗效，不良反应小而受到世人的瞩目。同时，西药的研制难度越来越大，周期越来越长，投入越来越多，迫使许多国家将目光转移至中药，这给中药走出国门带来了难得的机遇。但中药的化学成分复杂，质量难以控制，是传统中药制剂的痼疾，这也成为中药跨出国门的“瓶颈”。 中药特别是中药复方，包含许多个化学成分，其疗效是整体协同的结果，因此对其物质基础的反映，不能仅仅从一个或几个成分进行说明，需从整体性上进行阐述。中药指纹图谱具有整体、宏观和模糊分析等特点，可以通过对中药整体特性的描述，采取适当模糊的处理方式，达到整体质量控制的目的。目前，美国FDA、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受指纹图谱的质量控制方法，这表明指纹图谱已成为国际公认的控制中成药、天然药物质量的最有效的方法。因此，为实现中药质量标准现代化并与国际接轨，国家食品药品监督管理局已下发了中药指纹图谱研究要求，首先要求对中药注射剂进行指纹图谱研究，并正在抓紧进行指纹图谱库的建立工作，以逐步实现中药材、中成药质量标准现代化。 中药指纹图谱需要结合现代分析技术手段。针对中药指纹图谱的研究所涉及的方法种类繁多，主要采用色谱方法分离特征成分；采用UV、IR、NMR、MS等光谱方法鉴定化合物的结构，提高指纹图谱的可信度。主要方法有TLC、 TLCS、 GC、GC－MS、 HPLC、HPLC－MS、 HPCE、IR，UV、 NMR、X射线衍射以及DNA探针和生物色谱技术等，其中，色谱方法是主流方法，在中药指纹图谱研究中有着广泛的应用。下面就目前常用的中药指纹图谱进行论述。 1 薄层色谱(TLC)和高效薄层色谱(HPTLC)指纹图谱 谢培山等早在1987年就报道了人参类药材HPTLC指纹色谱图像分析。此后，又采用TLC建立了黄连的指纹图谱，结果显示，各原小檗碱型生物碱均为灵敏度很高的亮黄色荧光斑点，是其特点；其次，表小檗碱及黄连碱的有无或多少则构成相应的区别。 2 气相色谱(Gc)及气相色谱- 质谱联用(GC—MS)指纹图谱 毛细管气相色谱所包含的大量特征成分数据，犹如人类的指纹，具有特征代表性，在中药成分研究中主要用于中药挥发性成分的分离、鉴别。 洪筱坤等对柴胡属19种植物挥发油的GC指纹图谱进行研究，首次利用GC的定性参数—相对保留值建立了柴胡属19种植物挥发油的GC指纹图，并根据指纹图谱中色谱峰的重叠率和八强峰进行分析对比研究。结果表明同属不同种植物的指纹谱、重叠率和八强峰各不相同，认为该法可为植物品种的鉴定以及新种的确定提供有益的信息，并为 GC在分析复杂组份的样品方面开辟了先河。王智华等在檀香木挥发油的GC分析研究中，同一品种印度产的檀香木和印尼檀香，两者指纹图谱有一定的相似性，即它们的重叠率在60％左右，但主成分a－檀香酸和β-檀香酸的含量却有较大的差异。同产地、同品种的檀香，它们的重叠率在70％以上，上述两种主成分，在8强峰中均位列前3之中。将GC指纹图谱用于中成药麝香保心丸的鉴定，鉴定冰片、麝香、苏合香和桂皮。 吉力等用GC—MS联用法分析了草麻黄、中麻黄和木贼麻黄挥发油的化学成分，并测定了各成分的相对百分含量，共鉴定了127个化学成分。刑俊波等用此方法对不同产地金银花挥发油进行了比较分析。 3高效液相色谱(HPLC)及高效液相与质谱联用(HPLC—MS)指纹图谱 HPLC是20世纪60年代开始的一项现代分析技术，是在液相色谱的技术基础上，结合气相色谱技术发展起来的，具有高效、快速、灵敏、重现性好、应用范围广等特点，目前已成为中药质量控制的首选方法，适合于中药复杂成分的分离、分析和指纹图谱的建立。洪筱坤等在大黄的研究中，以《中华人民共和国药典》收载的3种正品大黄的9个样品为基准，对来自全国各地的10个样品进行了指纹分析。结果表明，利用正品大黄的HPLC指纹特征易于区别非正品大黄，且与生药鉴定结果相符。张聪等对中国红参和高丽红参进行了HPLC指纹图谱比较研究。它们相互间的色谱重叠率在65％以上，即使3个高丽红参样品，它们之间重叠率仅为 63％～66％；从各样品的8强峰来看，有8个样品的相对面积总和在55％以上，表明国产红参和进口高丽红参的品质十分接近。 张尊建等采用HPLC－UV－MS法对丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液进行指纹图谱的研究，得到了分离较好的丹参药材、中间体及注射液的HPLC－UV－MS指纹图谱，为丹参药材、中间体及注射液的质量控制提供了全面、可靠的依据。张皓冰等采用HPLC—MS联用技术，测定样品中麝香酮的含量，同时实现了麝香酮的定性与定量分析。 4高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱 HPCE技术在中药材鉴别中的应用是近几年发展起来的，它具有高效、快速、分辨力强、重现性好的特点，在中药质量标准制订方面的优势越来越明显。用该法鉴别菟丝子、海马、海龙获得了成功，在黄酮苷、生物碱的分析中，也得到了满意的结果。王钢力等对11种卷柏属药用植物进行了HPCE指纹图谱研究，建立了18个样品的毛细管电泳的指纹图谱。结果显示，各主要色谱峰的DAD光谱均显示黄酮特征，说明卷柏属植物在黄酮类成分上既有共性，也存在差别，这种差别对于药材品种的鉴别有着一定的意义。 5傅里叶红外光谱(FTIR)指纹图谱 FTIR技术作为构建指纹图谱的组成部分，在中药标准的构建中也发挥着相当重要的作用，尤其是这一技术作为中药鉴别的辅助手段，近年来发展较快。周红涛等首次运用FTIR对不同产地芍药根部的混合化学系进行了全组份快速分析，为赤芍道地商品的鉴别及质量控制提供了可靠的依据。程存归等采用FTIR直接测定延胡索及其伪品的红外光谱。 6 紫外光谱(uV)指纹图谱 UV也是常用的分析手段之一。据报道，有人不经分离直接用UV对32种石斛粉末的氯仿液进行了测定，并利用主成分分析法进行了综合分析，获得了满意的结果。随着计算机的应用，利用导数光谱消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰，更加方便快捷。 71H—NMR指纹图谱：以1H—NMR指纹法鉴定植物类中药是反映中药的整体化学特征和中药多组份、作用多靶点的特点，对中药进行的基源鉴定和品质评价的研究。在规范的提取分离程序下所获得的中药特征总提物可被视为代表了植物中药的整体化学组成。植物中药特征总提物的1H—NMR指纹图谱不仅可用于其基源鉴定，同时，将其与特征总提取物的收率相结合，还可对植物中药的品质作出评价。 样品之间由于成分含量不同造成UV和IR图谱间的差别是不可避免的，加上提取物中难免残留少量溶剂，其吸收峰也会对图谱产生干扰。这些问题在1H—NMR谱中是较容易解决的，因混合物相对成分的变化对相对标准图谱不产生影响。因此，3种光谱法中，NMR是信息最多、重现性最好的鉴定方法。 对环草石斛的1H—NMR指纹图谱进行解析，结果表明不同来源的环草石斛样品，其1H—NMR指纹图谱有很好的重现性和高度的特征性。 8 x射线衍射Fourier图谱 中药材的X衍射Fourier图谱是药材中所含各种成分的衍射谱的叠加，从整体上反映一般成分和主要成分的分布概况，从而可能提供较全面的有鉴别意义的数据。X衍射既能反映中药材整体固有结构特征，又能表现来自局部成分变化的图谱化与数值化。它将在衍射空间中实现中药材的鉴定。吕杨等选用常用中药材茜草类、贝母类、山药类3组样品，应用X射线粉末衍射法进行图谱分析，获得了可用于标识中药材的衍射图形几何拓扑规律与图谱特征标记峰，由此观察到：不同产地茜草样品的相似性及其与欧茜草的差别；同属不同种贝母样品的相似性与差异；不同产地山药样品的相似性及与伪品的区别。研究结果预示着这一方法在揭示中药材道地性客观规律方面的广阔应用前景。对中药材山柰进行了x射线衍射Fourier图谱分析，该研究选择了不同产地和采集时间的植物药山柰与苦山柰的6个样品进行 x衍射Fourier图分析，获得了用于山柰与苦山柰鉴别的特征标记峰与衍射模糊图形，成功地识别了山柰与苦山柰。研究结果表明，x衍射Fourier图谱分析法尚可用于性状与组织结构相似，化学成分相近的中药材的鉴别。此外，吴云山等应用粉末X射线衍射Fourier图谱鉴定法对5个白芍中药材样品进行了分析，获得了白芍的标准X射线衍射 Fourier图谱及特征标记峰值。同时也显示了X射线衍射 Fourier图谱鉴定分析方法具有广阔的应用前景。 9 DNA指纹图谱 DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，且不受生长发育阶段、供应部位、环境条件的影响，已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景，并保持了强劲的发展势头。 近年来，PCR技术带来的基因操作的变革，使PCR技术不仅在医学、农学与进化生物学研究中广泛应用。同时也渗透到中药鉴定的研究和领域中。自1994年Cheng首次将任意引物PCR技术引人中药鉴定学，几年来结合PCR技术鉴别中药的研究得到了极大的发展，并正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法DNA分子标记鉴别。目前常用于中药鉴定的DNA分子遗传标记技术有RFLP、RAPD、AP—PCR、AFLP等。 曹晖等用聚合酶链式反应方法，包括臆断引物聚合酶链式反应(AP～PCR)技术和随意引物扩增的多态性DNA (RAPD)技术，获得了菊科地胆草属2种植物地胆草、白花地胆草和假地胆草属1种植物假地胆草以及4种商品苦地胆药材DNA指纹图谱，同时测算了其DNA指纹图谱的相似系数，据此可区别中药苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草。王亚腥等从保存9年以上的药材龟板和鳖甲中提取出DNA，并用细胞色素b基因片断的适用引物对，通过 PCR扩增到了长约500 bp的DNA片段，成功地对龟板和鳖甲进行了DNA指纹鉴定，为分子标记技术引进到中药鉴定提供了基础资料。 梁之桃等利用RAPD技术对正品柴胡及其混淆品进行分子水平鉴定，为中药柴胡类药材的分子鉴定提供依据，同时探讨了这5种植物之间的亲缘关系。杨美华等用 RAPD方法对正品和伪品大黄进行了指纹图谱的研究，为正品和伪品大黄的基原鉴定提供分子依据。 10分子生物色谱指纹图谱 现代分子生物学的发展，逐步阐明了体内神经介质、酶、受体在生命活动中所起的调节作用。分子生物色谱是把生物体内活性物质如酶、受体、传输蛋白等固定于色谱填料中，利用中药中活性成分与它们的相互作用，将色谱分离与分子生物医学二者的新成果紧密结合起来，建立有效成分指纹分析质量控制方法，并为组合中药的研究提供有效分子的结构信息。对于有效成分尚未清楚的中药，由于分子生物色谱以生物活性分子间广谱的相互作用为基础，也可利用其指纹分析法进行快速的质量监控。 ll多维多息特征谱 中药多维多息特征谱主要应用在中药分析鉴定以及确定中药中微量活性成分和／或未知活性成分。所谓多维，即采用多种分析仪器联用模式。目前最常用的是高效液相色谱 (或毛细管电泳)-二极管阵列检测器一质谱一质谱联用方式。所得的多维指纹图谱，包括了HPLC或CE所得的色谱峰图 (各个成分的保留时间)；DAD所得的在线紫外光谱图(on—line UV图)；一级质谱图(各个成分的质量)和二级质谱图 (某成分的特征碎片)。所谓多息，即特征峰应努力做到包括化学和药效两方面的信息。化学信息即上面提到的多维图谱。如何使其也能包含药效信息，可采用有效部分的概念来解决这个问题。建立多维多息特征谱的最大优点在于能较系统、较完整地解决中药及其制剂面临的保证药效和质量的难题。而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路。 12结语 中药指纹图谱是使用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系质量稳定性进行评价的检测方法。中药指纹图谱的研究充分吸取了色谱学、波谱学、基因芯片技术、现代分子生物学技术、化学、数学、计算机科学等领域内的研究成果和成就。随着计算机信息处理技术及仪器分析技术的迅速发展，各种技术的科学性、准确性和灵敏度的提高，使现代分析技术在中药指纹图谱研究中的应用更加广泛，这必将对中药现代化的进程起到巨大的推动作用。

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