细胞信号转导理论在中医药研究中的应用

细胞中具有调节细胞代谢、生长、增殖、应激、凋亡以及其他各种活动的信号转导系统，它们由能接收信号的特定受体(或其他具有接收信号能力的受体样结构)、受体后的信号转导途径，以及信号作用的终端所组成。每个信号转导通路由专一性信号转导蛋白组成，不同的信号通路间相互联系和作用，形成复杂的网络。各种细胞内外信号分子通过细胞内的信号转导过程，调节代谢酶、离子通道、转录因子等的活性，产生多种生物效应。细胞信号转导系统是一个新兴的多学科交叉的研究领域，研究内容几乎涉及到医学和生物学的所有学科。现笔者就细胞信号转导及其在中医药学研究中的应用作一综述。 1 细胞信号转导中的第二信使及其作用途径跨膜信息转导是膜受体与配体结合后诱导生成第二信使，将信息传入细胞内而发挥作用。最重要的第二信使有 cAMP(环磷酸腺苷)、Ca2+、IP3(三磷酸肌醇)、DAG(二酰甘油)等。通常真核细胞内由第二信使介导的细胞生物效应主要有 4条途径：①cAMP蛋白激酶A途径。其过程是激素与受体结合后，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶，增加cAMP的生成，后者激活蛋白激酶A，从而催化细胞内蛋白质的磷酸化，最终引起基因表达。②IP3、Ca2+一钙调蛋白激酶途径。配体与相应的受体结合后，通过G蛋白介导，激活磷脂酶c，生成第二信使 IP3，IP3；进入细胞后，引起细胞内Ca2+浓度升高，以激活Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(caM激酶)，后者可磷酸化许多蛋白质，从而引发细胞内一系列生物效应。③DAG-蛋白激酶c途径。当激素等与受体结合激活磷脂酶C后，磷脂酰肌醇一4，5二磷酸(IPI2)被水解，生成DAG，从而激活蛋白激酶C，后者磷酸化特定的蛋白，引起相应的生物效应。④受体一酪氨酸蛋白激酶途径。胰岛素受体及生长因子受体的一定部位的酪氨酸残基磷酸化后，就构成了结合位点，可以结合细胞内特定的蛋白质，并依赖受体的酪氨酸蛋白激酶活性磷酸化该蛋白质，从而将信息向胞液内传递。 2细胞信号转导与中医证型的关系 蛋白激酶c(PKc)是胞内第二信使的受体蛋白，在静止细胞中主要存在于细胞浆内，当细胞受刺激后，PKC被激活而转位于细胞膜上，对细胞的代谢、生长、增殖、分化等过程起重要的调节作用。研究表明，脾阳虚证大鼠模型肝细胞膜PKC活性明显下降，而肝脾细胞浆、脾细胞膜PKC的变化不明显。但健脾药附子理中汤主要提高脾细胞膜PKC活性。提示健脾药可能通过激活脾细胞PKC活性而发挥免疫调节作用。 酪氨酸蛋白激酶(PTK)是细胞信号转导中具有重要作用的酶类，它可以分别介导经TCR和BCR的淋巴细胞激活途径，对淋巴细胞的活化增殖和免疫应答起关键性的作用。张仲景曾首倡“四季脾旺不受邪”之说。为寻找脾虚证免疫功能紊乱的分子免疫学基础，利用细胞信号转导理论进行了初步研究，发现利血平脾虚小鼠脾淋巴细胞胞浆中及质膜上PTK活性均显著低于正常水平。提示脾虚时淋巴细胞PTK活力低下，影响了由其介导的淋巴细胞激活途径，从而抑制了T、B淋巴细胞的活化增殖，使淋巴细胞数目减少，增殖能力下降，生物活性降低，终致免疫功能低下。郑氏等通过手术去势切除性腺造成雄性大鼠肾虚动物模型，施加补肾中药，结果肾虚模型的红细胞膜蛋白激酶c(PKC)、Ca2+ -Mg2+ ATP酶活性明显低于正常对照组，而补肾中药可使肾虚雄性大鼠的PKC、 Ca2+ -Mg2+ ATP酶活性明显提高。表明补肾中药能够增强细胞膜的某些酶活性，纠正部分膜磷脂组成成分，使细胞膜的结构和功能、跨膜信息传递趋于正常。 3细胞信号转导在方药研究中的应用 齐氏等研究了桂枝汤对体温双向调节作用的机理，采用12％鲜酵母悬液背部皮下注射诱导造成发热大鼠模型，采用安痛定腹腔注射诱导造成低体温大鼠模型，均以桂枝汤灌胃治疗。结果发现，桂枝汤对发热大鼠模型可显著抑制其下丘脑中腺苷酸环化酶(AC)活性，降低异常升高的cAMP含量，而对低体温大鼠又可显著增强其下丘脑中Ac活性，增加异常降低的cAMP含量。谢氏等观察了大承气汤颗粒剂对大鼠肠平滑肌细胞内IP3的影响。体内外实验发现，50％、100％、 250％大承气汤可使肠梗阻大鼠肠平滑肌细胞内IP3含量明显-升高。IP3可介导肠道平滑肌的收缩，因此，认为大承气汤的通里攻下、增强胃肠道推进功能的作用很可能是通过激活肌醇脂质IP3信号转导系统，使胃肠平滑肌细胞内ca2+释放增加，再通过钙调蛋白间接地激活一系列的蛋白激酶而实现的。唐氏等探讨了四逆汤对大鼠心肌缺血β肾上腺素能受体(β AR)信号转导的机制。用心得安阻断β—AR，再以垂体后叶素造成大鼠心肌缺血，结果心肌缺血时β-AR密度上调，而血浆及心肌cAMP水平低于正常组，β AR K-1(β1-AR激酶)mRNA的表达增加；四逆汤能促进β1-AR mRNA表达，抑制β AR K-1 mRNA的表达，从而增加β-AR密度，使血浆和心肌cAMP水平明显上升。张氏等观察了参附注射液对吗啡依赖人神经母细胞瘤细胞SK-N—sH胞内Cae*浓度的影响，探讨其戒毒作用的细胞机制，建立了吗啡依赖细胞模型，Fluo-3着染细胞后，采用流式细胞仪测定参附注射液对神经细胞内 Ca2+浓度的影响。结果发现，参附注射液中、高剂量组神经细胞内Ca2+浓度显著升高，纳洛酮催促引起的细胞内Ca2+降低抑制。聂氏等探讨了脑溢安对出血性中风大鼠脑内磷酸化蛋白激酶(P- C-Jun)表达的影响和治疗机理。根据 Roserberg法复制大鼠脑出血模型，采用免疫组织化学方法观察脑出血后梨状皮质内P-C-Jun的表达变化，并用组织病理学方法分析脑皮质内神经元的损伤状况。结果表明，脑溢安治疗组较模型组脑内P-C-Jun蛋白表达弱，神经元受损状况轻。提示脑溢安下调脑内P-C-Jun蛋白表达，从而干预了丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。 中药肝症口服液对肝癌患者有抑制肿瘤生长、缓解症状和延长生存期的作用，实验表明对大鼠肝癌前病变有明显的阻断作用。殷氏等进一步观察了肝症口服液含药血清对 TGF a诱导人肝癌细胞增殖和信号转导因子ERK的影响，采用血清药理学方法，以病理鼠血清作对照，应用MTT比色法观察中药鼠血清对TGF a诱导人肝癌细胞SMMC一7721增殖的抑制作用，用免疫组化方法检测中药血清对信号转导因子ERK蛋白表达的影响。结果表明，肝症口服液含药血清对TGF a诱导的肝癌细胞SMMC-7721增殖有明显的抑制作用，抑制效应呈时间依赖性，肝症口服液含药血清能抑制ERK蛋白在细胞核中的表达，阻断TGF a在细胞内的信号。 大量临床和动物实验证明，中药固真方具有补肾益精延缓衰老的作用。顾氏等从细胞跨膜信息传递对固真方参与调节的环节进行了研究。在贴壁培养的成骨样细胞中加入 10-5～10-7稀释的固真方提取液，发现其可促进成骨样细胞对 PTH(甲状旁腺素)刺激细胞内Ca2+释出(增高0．72倍)；细胞内cAMP基础水平固真方组较对照组增高3．9倍；同时依赖 cAMP的PKA(蛋白激酶A)固真方组也较对照组增高2．6倍。表明固真方能提高细胞内第二信使ca2+、cAMP、PKA的水平，增强细胞内酶活性，促进该细胞的增殖。杨氏等通过血清药理学的方法，以不同浓度的含化痰散结方的兔血清与人肺癌细胞SPC—A1共同孵育不同时间后，发现SPC-A1细胞内 36、48 h cAMP浓度升高，cGMP浓度无明显变化，cAMP／cGMP比值明显升高。认为化痰散结方含药血清诱导SPC—Al细胞凋亡与细胞内cAMP／cGMP比值升高有密切关系。 4细胞信号转导在中药研究中的应用 何氏等剀选用犬基底动脉全段结扎脑缺血模型，观察了海风藤对犬脑干缺血后脑组织细胞内Ca2+含量的影响，发现海风藤(O．3 g／kg)可明显降低犬脑干组织细胞内ca2+含量，对脑干缺血具有保护作用。王氏等探讨了麝香-1对大鼠中性白细胞血小板活化因子(PAF)生成及细胞内钙水平的影响，采用体外温孵系统，以同位素掺入法测定PAF生成，以 Fura-2标记荧光法测定细胞内游离钙水平。结果显示麝香-1在1～100 μ g／mL浓度下可明显抑制中性白细胞PAF生成和细胞内游离钙水平升高，可能与其部分抗炎作用机制有关。李氏等研究了蜈蚣提取物HB对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用及其作用机制。采用MTT法观察不同浓度的HB对 Hep-2细胞的生长抑制情况，采用激光扫描共聚集技术分析 HB作用Hep-2细胞48 h后细胞内Ca2+、DNA含量的变化情况。结果Hep-2细胞用10、100 μ g／mL的HB处理72 h后，细胞存活率显著降低；用10 μ g／mL和20 μ g／mL的HB处理Hep-2细胞48 h后，细胞内Ca2+含量显著升高，DNA含量显著降低。一定浓度的苦参碱能诱导K562细胞分化，刘氏初步探讨其诱导分化的信号转导机制，发现苦参碱能抑制 K562细胞内的蛋白酪氨酸激酶活性，在<0．1 mg／mL浓度范围内，抑制作用具有浓度依赖性。陶氏利用激光共聚焦成像系统和荧光探针Fluo-3／AM监测离体单个豚鼠耳蜗外毛细胞 (outer hair cell，OHC)内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化，以及显微摄像记录OHC的运动情况。结果发现，阿米长星 (AK，4．76 g／L)使OHC[ca2+]i显著下降，伴随细胞可逆性的缩短变粗，恢复后细胞仍比正常短胖，胞膜折皱，核固缩。银杏叶提取物EGb761(O．2 g／L)在AK前或后加入均不能中断[ca2+]i下降及细胞收缩这一过程，但可以使AK所致的极低[Ca2+]i回升。此外，EOb761可以改善AK对OHC形态的不可逆损伤，提示EGb761对AK所致OHC损伤有一定的拮抗作用。王氏等探讨了柴胡皂苷(I)[sA(I)]刺激大鼠胰腺腺泡酶分泌的信号转导通路，研究了GTP Y s对SA(I)刺激通透腺泡细胞酶分泌的影响。结果显示，GTP Y s能诱发酶分泌， lO-7mol／L sA(I)刺激酶分泌量增加到1．6倍。用SLO(链球菌溶血素O)预通透腺泡10 min后，加入GTP Y s使SA(I)刺激酶分泌的量一效曲线左移、SA(I)的ECho从2．0×10-5 mol／L减少到1．O×10-5 mol／L，结果提示SA(I)活化受体偶联的G蛋白包括在其刺激酶分泌的信号转导通路中。饶氏等研究了前胡丙素(Pra-C)对血管紧张素II(Ang II)致离体培养大鼠血管平滑肌细胞(sMCs)肥厚模型胞内游离Ca2+浓度、NO含量和信号转导的影响。以Ang II刺激SMCs形成肥厚模型，用倒置显微镜测定SMCs面积；用Fura-2／AM测定单细胞内[ca2+]i，Griess法测定N0含量；在PMA和ST(PKC激动剂及抑制剂)、PTX(Gi蛋白敏感毒素)作用下观察Pra-C对KCl和NE所致胞内[Ca2+]i浓度变化的影响。结果Pra-C组SMCs细胞面积较肥厚组减小39．01％，并接近正常细胞水平；N0含量明显增加；胞内[ca2+]i对KCl和NE激动的反应明显低于肥厚组。PMA使肥厚SMCs[Ca2+]i升高，而ST及PTX则使之降低，Pra—C均使之恢复正常。张氏等研究了三七总皂苷 (PNS)对烫伤早期大鼠心肌Gs a mRNA表达的影响。采用30％体表面积皮肤III度烫伤大鼠模型，观察三七总皂苷对严重体表烫伤大鼠心肌Gs a mRNA表达水平、cAMP产生量、腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)活性的影响。结果大鼠心肌组织中Gs a mRNA表达量、cAMP含量、Ac活性在烫伤后3 h均明显降低；100、200 mg／kg PNS明显增加烫伤大鼠心肌组织Gs a mRNA的表达，增加量与PNS剂量呈显著正相关； 100、200 mg／kg PNS使烫伤大鼠心肌组织cAMP含量分别增加21％、36％，Ac活性分别增强40％、63％。李氏等探讨了灵芝多糖(GLP)对细胞信号转导过程的影响，采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术动态监测GLP均一体组分GLB7对小鼠腹腔巨噬细胞(M0)胞浆游离[Ca2+]i的影响。结果GLB7(20μ g／mL)引起小鼠腹腔M0中[ca2+]i明显升高；GLB7引起小鼠腹腔M0外钙内流及M0内IP3敏感和IP3非敏感钙池释放 Ca2+、[Ca2+]i升高；GLB7对Mo[Ca2+]i的影响与K+通道及其引起的膜电位变化无关。因此，认为GLB7引起M O中[ca2+]i快速升高可能是灵芝多糖产生作用的重要途径。 救脑益智胶囊在临床上对一些脑萎缩病人有一定治疗效果，已证明该药具有促进神经元胞体增大和延长突起的作用，可能与其促进线粒体功能(MTT试验)有关。赵氏等应用半乳糖老化模型小鼠观察救脑益智胶囊对海马神经元的保护作用，发现生理盐水组小鼠海马神经元Akt／PKB(蛋白激酶 B)、CREB(cAMP response element binding protein)和Bcl- 2的免疫组化阳性细胞数明显减少，而AIF(凋亡诱导因子)明显增加，PP-1(蛋白磷酸酯酶-1)也明显减少。小剂量救脑益智水提液组上述改变恢复正常，而大剂量组却无此作用。 白藜芦醇具有抗癌、抗增生性疾病的作用，能抑制DNA复制，干扰细胞周期，还能干预MAPK信号转导通路。 Monwafy发现，将白藜芦醇短期作用于猪冠状动脉后，能抑制血管平滑肌增殖和收缩，并具有明显的MAPK活性抑制 (IC50=37 μ mol／L)。用免疫印迹检测可发现ERK-1／一2磷酸化水平增加，JNKl和p38下降。 5细胞信号转导与针灸作用机制的研究 针灸效应的产生实质上在很多时候就是第二信使介导的细胞内生物效应的体现。cAMP和cGMP参与调节细胞的生理生化过程，产生一系列生理效应，与经络现象、针刺效应及经络信息传导有关。神阙对人体各脏腑组织具有广泛而良好的调节作用，研究表明，正常大鼠神阙穴位组织内的cAMP、cGMP含量明显高于肾俞穴，但电针肾俞穴时，两穴位cGMP的差异消失。钙离子是经络活动的关键因素之一，研究表明，经穴处的Ca2+浓度高于非经穴处，针刺本经穴位可使本经其他穴位处的Ca2+浓度升高；当脏腑发生病变时，相应外周经穴处的Ca2+浓度存在特异性变化；当络合针刺穴位处及相应经脉线上的Ca2+、或阻断穴位处的Ca2+通道、或拮抗经穴处的钙调素活性，针刺效应均消失。采用手十二井穴刺络放血，对脑缺血引起的脑组织活性钙调素升高有一定的抑制作用，从而保护了脑细胞。中枢神经递质的作用是经细胞内的环核苷酸而传递的，针刺镇痛的机理也应与环核苷酸有密切的联系，通过测定脑内cAMP、cGMP含量的变化，证实了中枢环核苷酸在针刺镇痛中的重要作用。 6展望 综上可知，细胞信号转导理论在中医药研究中已有一些应用，但尚处于起步阶段，还很不完善，存在研究面窄(只涉及中医的几个证、少数处方、极少数中药的有效成分)、没有进行较大样本研究等方面的不足。细胞信号转导系统在维持生物机体的完整统一和协调各种生物功能中有重要作用，几乎所有疾病都或多或少地与信号分子和信号转导过程异常有关。随着科学技术的飞速发展，中医药的基本理论及防治疾病的机制正在逐渐被诠释。中医药的现代化研究应该与信号转导系统紧密结合，来阐明中医药作用机制。研究内容及切入点可从以下几方面展开：①中医的“证”与细胞信号转导系统关系的研究，有利于对“证”本质的认识；②中医基础理论，如阴阳的本质、阴阳消长的联系途径、五行的生克制化、脏腑的功能及相互影响的途径、“六淫”和“七情”致病的机制等与细胞信号转导系统的关系；③中医的治法，如活血化瘀、清热解毒、疏肝解郁、养心安神、温肾助阳、润肺止咳等治法与细胞信号转导系统的关系；④中医方剂及临床研究，如四物汤、四君子汤、补阳还五汤、六味地黄丸等经方、名方以及一些行之有效的经验方治疗相应病证的信号转导机制；⑤针灸经络与细胞信号转导系统的关系研究，如经络一脏腑相关的信号转导机制，循经感传、针刺麻醉、针灸治病原理、针刺补泻手法等与信号转导的关系；⑥单味中药及其有效成分治病机理与信号转导的关系；⑦信号转导系统异常与疾病的关系，以信号转导的异常环节为靶点，寻找有效的治疗药物。

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