日本汉方药研究的前沿

现代基因技术的发展，通过基因重组、转录使药用植物变异、繁衍，在很大程度上解决了自然药用资源匮乏或濒临灭绝的问题。日本学者正致力于在基因水平阐明汉方药韵应用指征“证”，以及汉方药有效成分在体内的变化过程。 l药用植物、生药的新动向 2000年12月，作为高等植物的模型植物拟南芥的全部基因序列被确定，这标志着生物科学新的里程碑，对和汉药及其药用植物资源将带来重大的影响。能否将基因组、后基因组测序的研究用于汉方药与药用植物的研究已成为大家关心的问题。 基因重组植物有第一代、第二代的说法，第一代指农业方面如除草剂的耐受性、制作对昆虫有毒性的蛋白等；第二代为进行基因转化，在医药学领域有明确的目的性，如制作药用成分产率高的植物体等。尽管有生物学的中心法则，但有各种各样的修饰。将 DNA携带的遗传信息复制即可遗传。性状的产生经 RNA以蛋白形式表达，成为表达型。传统遗传学是从表达型反向研究，最终确定基因。一个生物基因组序列的确定，又称为反向遗传学，即从基因到最终确定该基因表达型后，其战略就被决定。至少有基因片段或全部基因组序列，加上自上而下的工作手段，就可进入植物学领域的研究。 齑藤等数年来从事成分变异的分子生物学基础研究，成分变异只是次生代谢成分的不同。以红紫苏和绿紫苏为模型材料进行说明，两者同为紫苏，但化学变型、成分变型的红紫苏含有花色素苷，而绿紫苏则没有。紫苏色素特异性存在于叶子上表皮和下表皮细胞，在茎只存在表皮的一层细胞，这一组织特异性是色素产生的主要原因。决定紫苏颜色的因素很可能与以下3方面有关：①红紫苏存在花色素苷的生物合成基因，而绿紫苏没有；②红紫苏有基因表达、而绿紫苏没有；③虽有基因表达、但蛋白失去功能。即存在着基因组水平、转录物水平、质体、蛋白质水平等多层次不同，而出现2种的物质。 控制基因合成有两种情况，一是主管生物合成的全部基因未表达；二是某一关键步骤中的基因未表达。又如，红葡萄和无色葡萄，只有一个3GT(3-糖基转移酶)未表达的区别。红紫苏和绿紫苏具有相同的基因，只是基因表达的分布图不同。推测优位调控生物合成基因的调节基因是决定红、绿不同颜色的关键所在。从参与生物合成调控基因的3个基因组中分离得到的Myc样转录因子，这是具有碱性螺旋一环～螺旋结构域(bHLH)的转录因子，从人体癌组织中得到的基因以及具有重复色氨酸和天冬氨酸单一序列的调节基因(WD40)。首先，为了基因重组，将从红紫苏中取出的Myc基因导入载体，红紫苏的Myc基因成为异种植物的转录调控基因，再导入烟草和西红柿中。 基因重组后烟草花色较对照植物花的颜色鲜艳，说明花色素苷的生成非常旺盛。同样将红紫苏的Myc基因导入西红柿中，基因重组后植物茎变红，表明花色素苷在起作用。由此表明，紫苏的Myc基因，确实参与花色素苷的合成，该基因大量表达，就可大量制作花色素苷。 从Myc家族中得到Myc-rp和Myc-F3G1 2个基因，从Myb中得到2个基因，与从WD40因子中取来的1个基因，通过光诱导花色素苷的生物合成基因发现，红紫苏因光诱导具有特异性。加入Myc-rp后转基因植物花色素苷的生成增加；如果只加入 Myb-pl，则花色素苷的生成增加不明显。WD40转录因子也可使花色素苷的生成增加。总之，转录因子的组合是最终决定紫苏颜色的因素。 用示差显示法和分离红紫苏特异性表达基因法克隆的基因中红紫苏所具有的特异性，但是有生物合成过程中不能定位的蛋白基因(8R6)，该基因与新的花色素苷生物合成、蓄积等未知功能有关，也可能是新的基因。 根据蛋白排列推测8R6为膜结合蛋白。用水母的绿色荧光蛋白(GFP)与未知作用的8R6蛋白结合，导入拟南芥成为转基因拟南芥。从基因重组的拟南芥中分离原生质体裸细胞、液泡，发出绿色光的部分即是液泡。8R6与GFP发出荧光的部分就是液泡膜局部的蛋白质。液泡是储藏花色素苷的部位，花色素苷进入液泡中，其pH值为酸性，故呈红色。液泡膜中的8R6可能是向液泡输送花色素苷所必需的蛋白质。拟南芥基因重组过程中，8R6蛋白质作为非常强的启动子，推动导入拟南芥，于是，拟南芥蓄积大量花色素苷。可以认为，8R6在拟南芥蓄积花色素苷时有重要作用。现在尚不知紫苏的基因组序列，通过上述研究可知，紫苏与拟南芥有3个(anml、anm2、anm3)相似的基因组序列。分析3个基因表达模式，结果， anml与花色素苷累积密切相关，即anml直接影响着花色素苷的产生。 临床应用的从植物中提取的抗癌生物碱有4种： ①双吲哚型生物碱长春新碱、长春花碱；②紫杉醇；③鬼臼毒素；④喜树碱。喜树有较强抗癌作用。实际上，生物合成喜树碱的最终结构是喹啉型，源于吲哚生物碱，是由色氨酸和栊牛儿醇二种途径结合后的关键化合物，通过异胡豆苷(strictosidine)合成喜树碱。现代工业化生产的喜树碱是从喜树等植物中提取的。数年前开始研究，从茜草科蛇根草属植物中提取喜树生物碱并进行基因重组。短小蛇根草(Ophiorriza pumila)是一种稀有植物，只生长于日本的冲绳岛。因为资源匮乏，不可能用这种植物生产喜树碱。但通过感染发根病土壤杆菌，使短小蛇根草基因重组无限增殖、变成有根形状的植物培养体(毛状根)。毛状根具有良好的生产喜树碱能力。预计将来的工业化生产中，使用基因重组体，可生产出更有临床应用价值的抗癌药物。后基因组技术用于药用植物的研究中，还存在很多问题：①到目前为止，只阐明了拟南芥和稻的基因序列，但药用植物与农用的大米、小麦不同，所使用植物种类繁多，而基因组的序列研究，只能通过模型植物逐步进行。拟南芥和稻的基因组不能很快应用于药用植物。②新的生物基因测序，可以说30％是全新的序列。目前还不能根据已知序列进行推测尚不明序列的30％。具体到药用植物的研究，则必须分别研究其最终所属科、属的代表植物。如唇形科植物的紫苏、鼠尾草等；茜草科植物不仅用茜草，还用蛇根草。基因工程有必要对各科各属药用植物逐个进行研究。 2汉方药活性成分在体内的动态研究 2．1 药效的个体差异与基因诊断药效的个体差异(汉方称为证)，分为血药浓度和药物感受性等的个体差异。血药浓度的个体差异与患者的药物代谢酶、输送药物的蛋白质表达有关。目前正从与药物反应性的相关性进行基因多样性分析 (基因诊断)。以药物代谢酶的基因诊断为例，细胞色素P450(CYP)2C19的基因多样性，与用于消化性溃疡的奥美拉唑(质子泵阻滞剂)的血药浓度有关。根据基因多样性CYP 2C19可分为PM和EM。部分受试者没有代谢奥美拉唑等药物的能力(日本人中 20％属于此类)，这些受试者血中奥美拉唑的浓度非常高。这是由于编码CYP 2C19的基因发生变异、 CYP 2C19表达降低。EM患者的奥美拉唑血中浓度非常低，杀菌作用约为30％；而PM的杀菌作用几乎为100％。表明由于CYP 2C19的基因多样性，应用奥美拉唑后的药效完全不同。 2．2汉方药有效成分的吸收 本间等对柴朴汤如何在体内吸收及其血药浓度进行了研究，给健康志愿者服用柴朴汤，分析服药前后血、尿中药物的变化。结果在血、尿中发现木脂素、类黄酮、三萜类等11种化合物。这些成分并非含于柴朴汤中，而是柴朴汤所含成分在人体内代谢生成的代谢物。研究服用柴朴汤后血、尿中出现的化合物与抗过敏作用是否有关，通过抑制白三烯游离活性试验发现，汉方药成分与抗过敏药盐酸氮革斯汀的药理活性相当。实际上，同一方剂并不是对任何患者都适用，原因包括：①血中化合物的浓度有很大的个体差异；②大部分化合物以无活性的结合型在血液中循环。对 29名健康志愿者进行研究，每日3次口服柴朴汤，检测甘草、厚朴、黄芩中化合物的尿中排泄量，发现个体间存在较大的差异。如具有抑制白三烯游离活性的二羟苯基羟基丙酮(DG)的排泄量为2～12mg/d，个体间约相差6倍。 2．3制剂中影响血药浓度的因素 制剂成分含量的参差不齐，主要是源于天然的汉方药。1985年日本厚生省规定，汉方药成分的含量必须按经方的标准汤剂衡量。标准汤剂至少应含有2种指标成分，并规定含量的最低限，评价提取物制剂的成分时，允许规定的中心值可±50％，最好在± 30％以内。即如果要求含有100mg有效成分，实际允许含量范围为50～150mg，产品可有约3倍的误差。 关于提取物制剂成分含量的差异，如小柴胡汤含有多少毫克甘草酸并不显示在说明书上，但作为质量评价的数据标明批次间的差异。评价小柴胡汤时，要检测方中甘草酸、柴胡皂苷、黄芩苷，含量差异为 13％～15％。血药浓度的个体差异至少为给药量的 13％～15％。 2．4影响血药浓度的体内因素 汉方药中含有的有效成分多为苷元与糖结合后的糖苷，因其水溶性强不能直接吸收，需要通过肠内细菌的作用，转化成去糖的苷元才能被吸收。如甘草中所含的甘草酸就是甘草次酸与葡糖醛酸结合后的糖苷，必须通过肠内细菌的葡糖醛酸酶转化成甘草次酸才能被吸收。因而，分析血中甘草次酸的浓度，可了解肠内细菌吸收代谢物的情况。肠内细菌代谢活性低者，甘草次酸的吸收量也低。服用柴朴汤后各成分吸收的个体差异，可以根据消化道的代谢情况进行分类。参与糖水解与还原代谢的二羟苯基羟基丙酮个体差异最大(CV值为70％)。一般药物血中浓度的个体差异为25％，糖苷(甘草次酸等)水解的个体差异为40％～60％，被直接吸收的化合物约为30％，新药大致相同。 2．5汉方药有效成分的代谢 汉方药的有效成分被吸收后，在肝脏代谢而不被激活。肝脏的UDP葡糖醛酸基转移酶将木脂素、黄酮等酚类化合物转化成葡糖醛酸结合体，进入血液循环。黄芩中的黄芩黄素及其葡糖醛酸结合体对白三烯释放有抑制作用，游离的黄芩黄素活性较强，而结合体则不显示活性。 关于体内结合型和游离型比率对汉方药效的影响，以柴朴汤治疗哮喘为例，用服药前后52周喘息分数的变化判断疗效。哮喘的分数因症状加重而增加，但服用柴朴汤后有效病例哮喘分数减少，症状改善；无效病例则哮喘分数未见变化。对尿中葡糖醛酸和厚朴酚的排泄量进行调查，所有病例尿中结合型排泄量无显著差异，而有效病例游离型的排泄量增多。厚朴酚的结合能力低，推测使其不活化可能较困难。 2．6药物遗传学的应用 参与化合物结合的葡糖醛酸转移酶的活性直接关系到汉方药的疗效，该酶有基因多样性，与伊立替康(irinotecon)所出现的副作用有关。即编码启动子区域的TATA-Box有多样性，TATA反复6次的人酶活性正常，反复7次者酶活降低。伊立替康严重的副作用是腹泻、多发生于TATA反复7次、酶活性低下者。给予厚朴酚后，由于酶活性降低，游离型厚朴酚增加，可抑制腹泻。 虽经肠内细菌生成甘草次酸等，但未在脏器中代谢，即使检测患者的基因也难以了解化合物的血中浓度。这种情况应检测肠内细菌的基因。直接吸收的厚朴酚，进入脏器成为结合型化合物，如果诊断患者的结合酶基因，即可从某种程度上预测其药效。 在分析和汉药成分的体内动态时，应用药物遗传学，有应用困难和可能应用之分：应用困难的原因指吸收过程中被肠内细菌代谢；可能应用的原因为直接吸收后在脏器中代谢。后者在方剂中起主要作用，可通过患者的基因诊断予以确定；前者为需肠内细菌参与发挥主要作用的方剂，即使诊断患者的基因也难以预测汉方药的药效。 3汉方药应用指标“证”的研究 汉方医学诊断、治疗主要根据个体的“证”(体质与症侯)，而个体的“症侯”包括遗传与非遗传两方面因素，与现代医学的“个体化医疗”概念一致。以特应性皮炎实验模型动物为例，用抗DNP-IgE抗体被动致敏或DNP-OVA+Alum主动致敏后，在小鼠耳廓涂抹DNFB诱导皮肤反应。该模型小鼠出现反应后lh的第一高峰为速发相反应(IPR)，24h至48h的高峰为迟发相反应(LPR)，即二相性反应。继续观察，第8d出现的高峰(三相反应)，称为极迟发相反应(vLPR)。三相性皮肤反应中，IPR时肥大细胞起重要作用；LPR时中性细胞、巨噬细胞、部分T细胞参与，可观察到嗜酸性细胞浸润；vLPR时嗜酸性细胞大量浸润。T细胞缺损的小鼠耳廓肿胀消失，表明该病变为依赖T细胞的病理反应。对各反应相进行病理组织学观察发现，模型小鼠的反应与人特应性皮炎的病理组织学所见极其相似。济木等观察12个汉方方剂对三相性皮肤反应的影响发现，桃核承气汤组对三相反应有抑制作用。将20个方剂对三相性皮肤反应可分为几类：小青龙汤、含有大黄的桃核承气汤及治头疮一方、以石膏为主药的白虎加人参汤与泼尼松龙作用相同，抑制IPR、LPR、vLPR三种炎症反应相。含有当归和黄芪的温补剂四物汤、当归饮子、黄芪建中汤抑制LPR、vLPR；清热剂黄连解毒汤、茵陈蒿汤，理气剂抑肝散对各反应相均无抑制作用。汉方医学注重“心身如一”，即精神、情感因素直接影响身体的各个方面，如特应性皮炎加重、慢性变或者癌的复发、转移，无不与神经精神因素有关。“证”受遗传性或非遗传性等各种因素影响、控制，但疾病的恶化应主要归咎于非遗传因素的影响。将小鼠隔离饲养增加其心理紧张程度后，癌症复发、转移的机率增加，这可能与包括NK细胞、巨噬细胞活性的各种免疫功能低下、慢性产生TNF-a、癌细胞的浸润能力及肿瘤血管新生能力增强有关。心理应激的隔离饲养小鼠，在耳廓涂以DNFB后引起的三相性皮肤反应明显重于普通群居的小鼠。对前者给予抑肝散，则IgE诱导的三相性皮肤反应被抑制。表明抑肝散对有心理因素影响小鼠的三相性皮肤反应有抑制作用，其作用呈剂量依赖性增强。这可能是方证相符与疗效的关系。 给予抗焦虑药地西泮，可抑制应激引起的IPR、 LPR增强。对于因隔离饲养应激负荷诱导小鼠的攻击性，地西泮有抑制作用、抑肝散对此无作用。但两者均对应激导致的自发性运动量增加有抑制作用。 心理应激等多种因素对“证”的影响属于非遗传性，体质主要与遗传有关。IgE介导的三相性皮肤反应与所用模型动物的种类有关，BALB／c、DBA／2、 DBA／1小鼠为高反应性；SJL、C57BL／6N、C3H／HeN小鼠为低反应性。 不同种属小鼠IgE介导的三相性皮肤反应不同，如C57BL／6N小鼠产生较高的IgE抗体，观察到低的三相性皮肤反应。SJL小鼠几乎不产生IgE抗体，所以不出现过敏反应。C3H／HeN和CBA／J小鼠尽管具有相同的主要组织结合性抗原H-2k单元型，却有明显的反应差异性，特别是CBA／J小鼠在有肥大细胞参与的IPR反应强烈。MRL／Hpr小鼠vLPR反应明显。 证在受遗传性、非遗传性因素调节、控制的同时，也与疾病相关基因等多种决定因素有关，应用分析以整体基因组为对象的新技术(DNA芯片和微陈列等)，综合评价汉方方剂基因水平的表达(基因组的群集)，导入蛋白质解析技术(条形码分析)、经蛋白质芯片系统捕获的血浆蛋白质等的表达，阐明证一效果一方剂等之间的相关性。 寺泽对“瘀血”的病理表现和血液流变学的关系进行研究发现，瘀血患者红细胞变形、血液黏稠度增加，服用桂枝茯苓丸得以改善。高尿酸血症的患者服用桂枝茯苓丸后，瘀血得分从24降至15；对贝赫切特病患者服用桂枝茯苓丸前后蛋白质芯片的血浆图式进行分析，芯片表面捕获的蛋白质经脉冲式激光照射后从表面分离，离子化的从固相中飞行。离子化的蛋白质飞行时间型质量分析计(TOFMASS)测定质量数和离子强度，分子量小的飞行快、分子量大的飞行慢。分析服用桂枝茯苓丸后血浆蛋白质组图式，结果出现了反应该药有显著效果的特征性峰，以此为基础进行证的诊断，可使汉方方剂的应用简单化。比较瘀血患者与正常人的蛋白质表达，瘀血患者无论是贝赫切特病、风湿病，还是高尿酸血症，均可检出作为瘀血诊断标记物的特有的复数蛋白质。服用桂枝茯苓丸后，几种蛋白质均有向健康人水平变动倾向。 汉方医学的辨证，与西医病名诊断有明显的不同，在贝赫切特病、风湿病等各种疾病自身特征性标记的基础上，明确瘀血标记特有的数据，这在用现代医学解释、理解汉方医学时显得尤为重要。 摘自《国外医学》文/柯青

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