桔梗栽培及野生种质遗传多样性的RAPD分析

魏建和 杨成民 陈士林 程惠珍 中国医学科学院 药用植物研究所 北京 100094 中国协和医科大学 黄璐琦(中国中医科学院中药研究所 北京 100700) 遗传变异是中药材品种改良的基础，对种质遗传多样性的准确评价可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平预测提供预见性的指导，这是关系到育种目标能否成功实现的关键；遗传多样性度量和保护同样是生物多样性研究的核心问题，也是保护生物学的重要内容。包括RAPD在内的DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映，已广泛用于植物遗传多样性和亲缘关系研究，近年在药用植物遗传多样性研究中也日趋增多．如银杏、丹参、人参、鱼腥草、菊花、罗汉果、山药、红花等。 桔梗(Platycodon grandi~rum(Jacq．)A．DC)为桔梗科多年生草本植物。是我国销量最大的40种传统中药材之一，性子，味苦，辛，具有化痰止咳、利咽开音、宣畅肺气、排脓消痈的功效。我国、日本、韩国作药用，我国东北和韩国还大量食用。欧美、日韩也作为切花等园艺观赏植物[9-121。我国桔梗从20世纪70年代起开始栽培。种植技术已基本成熟，在山东淄博、安徽亳州、太和、内蒙赤峰形成三大道地种植产区。作为观赏植物和切花，国外培育出了10余个桔梗新品种，韩国选育了药用“白花”桔梗品种叫。中国还没有桔梗优良品种，我们正在选育杂交品种04-t5]，但桔梗栽培群体和野生群 体遗传多样性研究还没有报道，为此开展本研究。 一、材料与方法 1。植物材料 供试材料共11种27份种质92个样品(表1)。4种栽培种质来自我国桔梗主要栽培产区安徽亳州和太和、内蒙古、山东，共20份；3种野生种质来自北京、河北承德、山东淄博，共3份；4种育种遗传材料，共4份。栽培种质和野生种质以种子形式从各产地收集，播种于中国医学科学院药用植物研究所内。遗传材料来自同一份从安国市场购买的桔梗种子，通过多代自交将原群体中的紫、白、粉花植株纯化为花色不再分离的3个花色纯系，花色分离株为原始材料。7-9月桔梗植株生长旺期采集新鲜叶片用于DNA提取。 2。样本DNA的制备 采用2．5％W／V CTAB(Cedy trimethyl aln．moniumbromide．十六烷基三甲基溴化胺)法提取新鲜健康嫩叶的总DNA，并保存于0．1倍了E中。 3．RAPD-PCR程序设计与电泳检测扩增产物 (1)RAPD反应体系。 RAPD引物和dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Taq酶购自上海申能博彩科技有限公司。PCR反应体系共25wL，包括：ddH20 14wL．10*buffer 2．51~L，Mg2+(25mM)2μL，dNTP (2．5mM)2μL，Primer(15ng／μL)2．01~L，模板DNA(2ng／l~L)2．01~L，TaqE(2．5U／μL)0．51~L。 (2)PCR扩增。 PCR反应在Gene Amp PCR SYS丁EM 9700上进行。反应程序：94~C预变性，4min；94℃变性,30s，35℃，lmin，72℃，2min，45个循环；72'12．10min，整个反应程序约4h。扩增结束后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产，溴化乙淀染色．凝胶成像系统拍照保存。 4．多态性引物筛选 从北京延庆、山东淄博、安徽亳州，太和、内蒙赤峰种质中各取1份DNA样品对264条10碱基随机引物进行了初步筛选，252条引物扩增出条带，80条引扩增出特异性条带，从中选6条重复性好、条带清晰的特异性引物(见表2)对92个样品基因组DNA扩增。 5．数据分析方法 对所扩增DNA条带量化为l或O(条带存在为1，条带不存在为0)，在相同实验条件下，迁移率相同的条带视为同源位点。遗传多样性采用两个指标表示： 指标1：多态性位点比率P(Percentage 0f polymor-ohic loci)：多态性位点除以总位点数。 指标2：Nei's基因多样性指数(Ht)(或称总基因多：样性、平均期望杂合度)：Ht=l-(1／m ∑i∑j---mpij2)，pij为第i个位点的第i个等位基因的频率，m为检测的位点总数。 遗传距离(Genetic distance)参考文献计算：D：1-2Nxy(Nx+Ny),其中Nxy为两基因型共同拥有的条带数,Nxy,Nxy为X和y基因型各自的条带数.利用UPGMA‘非加权配对算术平均法，unweighted pairgroup arithmetic averages me~od)聚类分析。上述分析采用POPGENE，“0”、“l”数据首先经DCFC软件进行处理，转化为POPGENE所用文件格式。 对所有单个样品，计算个体的RAPD标记表型值的欧氏距离(Squared euclidean distance)，采用SPSS进行聚类分析。 二、结果与分析 1．桔梗栽培、野生种质及遗传材料的遗传多样性所有样品扩增条带的分子量为490~3100bp。92个样品共检测到87个位点，58个为多态性位点。占66．67％，Nei's基因多样性指数Ht=0．2099(表3)。4种栽培种质中A丁多态性位点比率(P)最高。占29．89％。随后是AB、NC和SZ， 分别为28．74％、28．74％、22．99％，合计47．13％。野生材料P值SB>BY>HC．分别为12．64％、10．34％、6．90％，合计44．83％，比栽培种质遗传多样性略小一些。遗传材料中，PP、PW、PM的PPB分别为17．24％、5．75％、O％，表明经过人工选择后，遗传多样性明显降低，纯合度增加，特别是PM，个体间没有分化，遗传材料的总体P仍为39．08％．表明多态性基因仍然存在，各份遗传材料间遗传背景不同。Nei's基因多样性指数与多态性位点比率大小趋势一致。 2。桔梗栽培、野生种质及遗传材料的遗传分化 按桔梗种质的来源对11种种质基于Nei's遗传距离，利用UPGMA法对种质进行聚类结果如图1。所有种质92份样品的RAPD表型值聚类结果如图2。图1和图2结果一致。分析样品按照它们的来源分别聚为一类，即按栽培种质、遗传材料和野生种质三大类区分开，在各类种质中，又按产地来源各自聚类。 在栽培种质中，安徽亳州(AB)、太和(A了)的遗传距离最小，部分样品在聚类时有相互交错。这两个地区相距约100km，产地之间种源和商品往来多，遗传距离分析结果很好地反映出这两个产地间种质的遗传背景相似。山东(SZ)、内蒙(NC)两个北方栽培种质首先聚类，然后与安徽种质聚类，显示出种质间遗传距离与地理距离的关系。 野生种质中，来自河北承德(HC)和山东淄博(SB)的遗传距离较近，北京延庆(BY)野生种质较特殊，与其他两份野生种质的遗传距离较远．而与栽培种质的距离较近，具体原因尚不清楚。遗传材料中。白花纯系(PW)和粉花纯系(PM)、紫花纯系(PP)与原始材料首先聚为一类，反映出白花和粉花的遗传背景更相似，与紫花相对更大一些。 三、讨 论 1．桔梗种质的遗传多样性 研究表明桔梗栽培种质的遗传多样性较丰富(P值均在20％以上)，反映出我国目前栽培桔梗种质还是一个混杂群体，存在丰富的变异类型。为了保证桔梗外观和药材品质的均一和稳定，有必要对现有栽培群体进行纯化；另一方面丰富的变异类型为品种选育提供了很好的基因资源．有望从中培育出符合人们需要的优良品种。但各产地种质遗传多样性表现不同。山东淄博桔梗栽培已有40余年历史。种源基本来自本产区，外调种子很少，生产上长期的自然选择。导致山东种质(SZ)的遗传多样性相对较低。而内蒙赤峰(NC)和安徽太和(NT)等地种植桔梗有20余年，较短，同时与全国各地种源互换较频繁。遗传多样性相对较高。 我们对一份桔梗种质进行了人工定向纯化，RAPD分析表明其遗传多样性已很低，表现为三个遗传纯系材料的多态性位点比率分别为o％(PM)、5．75％(PW)、17．24％(PP)，特别是PM、PW纯系，已基本成为纯系遗传材料或有希望培育成为新品种(经济性状良好)。野生桔梗种质3个居群(HC、SB、BY)的遗传多样性均很低，这可能与采样数较少有关，但反映出了各个分布区野生桔梗的遗传多样性不高。 2．桔梗种质间的遗传分化 Tsuyoshi Saeki采用桔梗皂苷A、C、D的含量比例区分了来自中国、韩国和日本的桔梗。我们采用RAPD标记可以明显将中国主要栽培桔梗种质区分开来。遗传距离聚类结果表明我国安徽、山东、内蒙三大桔梗栽培主产区的种质已出现了明显的遗传分化。且与我们用于花色遗传纯化的材料。及各份野生种质的遗传背景不同。研究结果揭示出不同桔梗道地产区的种质类型不用。种质可能在不同产区药材品质差异中起到了重要作用。

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