蜀五加皮乙醇提取物对CCl4中毒小鼠肝 组织脂质过氧化的抑制作用

杨秀伟，服部征雄 (1．北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100083； 2． 日本国立富山医科药科大学和汉药研究所， 富山 930一0194， 日本) 在预防中医药学领域，中药的抗氧化作用在延缓机体衰老进程上日益得到重视。在世界当前医学领域位居人类疾病谱前3位的心脑血管疾病、癌症和糖尿病等皆与机体的氧化状态有关，尤其是自由基状态。在寻找中草药抗氧化作用成分的系统性研究过程中，我们曾报道了鹿茸、地血香、肉豆蔻假种皮、草苁蓉、木桔等的抗氧化作用。蜀五加皮是五加科蜀五加Acanthopanaxsetchuensis Harms ex Diels的根皮，主产我国四川、甘肃、陕西、河南和贵州，作为五加皮的代用品药eeeeet。本文旨在探讨蜀五加皮乙醇提取物对CCl4中毒小鼠肝脏组织脂质过氧化的抑制作用。 1 材料 1．1植物材料 蜀五加皮采自四川省宝兴县，由成都中医药大学顾哲明教授提供。标本存放在成都中医药大学中药学院标本室。 1．2试剂 硫代巴比妥酸(TBA)，十二烷基磺酸钠，l，1．3．3一四羟基丙烷(1，1，3，3一tetrahydroxy—propane)、还原型烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)，L一(+)一抗坏血酸，无水二氯化铁(FeCl2)，硫酸奎宁和吐温一80购自日本和光纯药工业株式会社。牛血清白蛋白(BSA)和腺苷5．一二磷酸(ADP)购自美国Sigma化学公司。DL一0一维生素E购自日本Nacalai 7esque会社。其他试剂系分析纯。体外生物活性实验使用超纯水。 1．3乙醇提取物的制备 取粉碎的蜀五加皮1．5kg，用95％乙醇3L回流提取5次，每次2h。减压回收乙醇，得蜀五加皮醇制干浸膏(ASE)60g(收得率为4％)。 1.4动物 体重24—25g(5周龄)的雄性小鼠。全部动物饲育在(23±1)℃室内，光暗周期为12h，饲喂标准实验室饲料，自由饮水。 2 方法 2.1动物分组 将小鼠随机分为5组(每组5只)，正常对照组、中毒对照组和给药组(100，300，600mg．kg-1．d-1ASE),连续5d。正常对照组和中毒对照组给予同体积的生理盐水。末次给药后饥饿16h,把CCl4一矿物油(1：1)按601xL／20g体重ip给予动物。正常对照组仅给予同体积的矿物油。 2．2测定 2．2．1小鼠CC]4中毒后2h，断头处死。按文献方法将肝脏迅速制成所需匀浆，并测定硫代巴比妥酸一反应物质(TBA—RS)、脂质共轭二烯、老年脂褐素和蛋白质含量。 2．2．2另取饲喂在(23±1)℃室内、饲喂标准实验室饲料、体重150g的雄性SD系大鼠(6周龄)断头处死，在4真(：将肝脏迅速摘出。取2g肝脏碎片加入到10mL的150mM KCl一Tris—HCl缓冲溶液(pH7．2)中匀浆。然后在500×g下离心10min，取上清液供离体实验用。 2．2.3对FeCl2一Vc所致脂质过氧化抑制作用的测定：将大鼠肝脏匀浆液o．5mL、150mM Tris—HCl缓冲液(pH7．2)0．1mL、6mM Vc溶液0．2mL、4mM FeCl2溶液O．1mL和ASE水溶液o．1mL混合后在37％温育1h。然后，取0．5mL该温孵液加入含有0．5mL的O．1mol。L—1HCl、O．5mL的O．9％SDS和0．5mL水的混合溶液中。振荡后再加入2mLo．5％了BA溶液，在沸水浴中加热30min。放冷后，加入5mL正丁醇，振荡，离心，取正丁醇层在532nm下测定光密度值。从丙二醛标准曲线查出了BA—RS量，换算为TBA—RS nmol／g肝脏湿组织重。 2．2．4对CCl4一NADPH所致脂质过氧化抑制作用的测定：将含大鼠肝脏匀浆液O．5mL、ASE水溶液0．2mL和100mM磷酸缓冲液o．19mL(pH 7．2)的混合液在37℃温育15min后加入2mM的NADPHo．1mL和10mL的CCl4乙醇溶液(o．9mL CCl4加9．1mL乙醇)，在37℃温育20 min。同上法测定TBA—RS量，换算为了BA—RS nmol／g肝脏湿组织重。 2.2．5对ADP—NADPH所致脂质过氧化抑制作用的测定：将含大鼠肝脏匀浆液O。5mL、ASE水溶液O．2mL和150mM磷酸缓冲液O．1mL(pH7．2)的混合液在37℃温育15min后加入4raM NADPH 0．1mL和40mM ADP O．1mL，再在37％温育60min。然后同上法测定TBA—RS量，换算为了BA—RS nmol／g肝脏湿组织重。 2.3统计分析 数据用x±S表示，采用Dunnettt一检验估价统计学显著性。 3 结果与讨论 3．卫用CCl4诱导小鼠肝损伤(肝中毒)，其毒性表现为形态学和生物化学上的变化，如肿胀、内质网破坏和降解、微粒体Ca2泵活性的抑制、微粒体葡萄糖一6一磷酸酶活性及包括细胞色素P450的药物代谢酶活性的降低。这些变化是通过肝脏药物代谢酶使CCl4产生自由基，引起细胞膜脂质过氧化所造成的。肝脏脂质过氧化程度可通过测定脂质过氧化物等来评价。 本实验探讨了ASE对CCl4诱导的小鼠肝脏组织脂质过氧化作用的影响，观察到小鼠ip CCl4后肝脏TBA—RS、脂质共轭二烯和老年脂褐素水平的增加。连续5d给予ASE，随后用CCl4中毒，可明显预防了BA—RS、脂质共轭二烯和老年脂褐素的升高，且呈剂量和效应的依赖关系，结果见表1． 3．2 FeCl2一Vc系统能产生短寿命种的OH．自由基，在生物体内接近扩散控制率的条件下，极易与大部分有机生物分子反应。这种扩散并非是OH。自由基从产生位置到疏水性细胞膜部位的简单迁移，而必定会引起细胞膜的脂质过氧化。由表2可知，当把ASE加入到FeCl2一Vc系统中时，明显抑制大鼠肝脏细胞膜的TBA—RS水平，提示ASE似有直接捕捉OH．自由基的作用。ADP—NADPH系统能够启动内质网膜的脂质过氧化。在浓度为100和200μg．mL-1下，ASE能够降低其丁BA—RS水平，结果见表2。在CCl4一NADPH系统，ASE的抑制作用比FeCl2一Vc系统和ADP—NADPH系统的都强。同时，从表2的结果还可看出：在3个自由基发生系统中，ASE在200μg．mL-1浓度下的抑制作用强于阳性对照组维生素E的抑制作用。这些结果证明ASE有捕捉自由基的能力，从而达到抑制生物体细胞膜脂质过氧化的作用。 传统上，五加皮单味药或配伍用来预防或治疗老年性退行性疾病，如免疫功能低下、动脉粥样硬化、高血压、内分泌紊乱、癌症、老年性痴呆、糖尿病等，这些退行性疾病多与机体处于高度氧化状态或与自由基的爆发有关。本文的实验结果为传统中药五加皮和蜀五加皮的“异曲同功”至少提供了一部分现代科学依据。

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