反相离子对色谱法测定鱼腥草素钠的含量

张志斌， 钱卫德， 杭亚军， 徐建琴 (上海汉殷药业有限公司，上海200080) 由鱼腥草素钠、四季青浸膏组成的复方四季青片，分别从抗病毒、抗感染两方面协同抗呼吸道感染，疗效显著。临床上用于风热感冒，咳嗽痰多，咽喉肿痛。该制剂收载于部颁标准第四册，检验项目中无[含量测定]，使其质量一直不能得到很好控制。最近，四季青浸膏质量已可通过测定其主要成分原儿茶酸、原儿茶醛而得到控制。为力求继续探讨如何控制该制剂中另一主要成分一一鱼腥草素钠的质量，今报道鱼腥草素钠原料的HPLC测定方法。 鱼腥草素钠为癸酰乙醛的亚硫酸氢钠加成物，测定方法有：紫外二阶导数光谱标准加入法L2l、UV法、碘量法，法定方法为碘量法。尚未见用HPLC法测定的报道。本文采用反相离子对色谱法测定鱼腥草素钠，切实可行，结果准礁可靠，重现性好，可克服用碘量法测定的缺陷。 1仪器与试药 1．1 仪器 美国HPll00高效液相色谱仪，VWD紫外一可见光检测器，HPl 100化学工作站，Rheodyne手动进样器，日本岛津UV-265FW自动记录分光光度计，SB3200超声波清洗器。 1．2 试剂 乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸、醋酸、醋酸铵、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵均为分析纯，超纯水。 1．3 对照品与样品 鱼腥草素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号为：0247-9601)；鱼腥草素钠原料(上海汉殷药业有限公司，批号为：990701，010301，030101，030301、040101) 2 测定方法与结果 2．1 色谱条件 色谱柱：Zorbax Cs 5μm，150 mn×4。6 mm；流动相：2mmol／L四丁基氢氧化铵溶液．乙腈(64：36)；流速：1。0mL／min；检测波长：283 nm；柱温为室温；进样量为20 μL。 2.2 色谱条件选择 2．2．1 检测波长及溶剂选择 取鱼腥草素钠对照品，用流动相超声溶解并制成约8μg/mL的溶液，进行紫外扫描。鱼腥草素钠能完全溶解并在283 nm处有最大吸收，故以此波长为检测波长，流动相为溶剂。 2．2．2 柱温选择 取同一样品溶液，于同日分别在室温(22℃)、柱温为42℃下各进样两针，结果鱼腥草素钠的理论塔板数依次为8 898、8 900、8 899、8 899，RSD为O．1％；峰面积依次为168 685、167 633、164 638、167 185，RSD为1．0％。说明柱效几乎不变，柱温对检测无影响，为避免加温对色谱柱的损害，所以采用室温作柱温。 2。3 供试品溶液的制备 取干燥至恒重的鱼腥草素钠适量，精密称定，加流动相超声溶解并稀释成含鱼腥草素钠约为24 μg/mL的溶液，摇匀，即得。另取鱼腥草素钠对照品，同法制备对照品溶液。 2．4 方法学验证 2．4．1 线性关系考察 取鱼腥草素钠对照品，用流动相溶解并稀释制成每1 mL含鱼腥草素钠O．080 1 mg的溶液，即为储备液，精密取储备液o．5，1.0，1．5，2．0，3.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。吸取上述储备液及稀释溶液各20μL注入液相色谱仪，依法测定，每个浓度重复进样2次，记录峰面积。分别以浓度C为横坐标，峰面积A的平均值为纵坐标，求得鱼腥草素钠的线性回归方程：A=1．289 5×10-2C+1．634 2×10-4，r=O。999 9；线性范围为：80．1—1 602μg/mL。 2．4．2 精密度试验 精密吸取鱼腥草素钠对照品溶液，注入液相色谱仪，记录峰面积，RSD值为1．O％(几=6)。 2．4．3 稳定性试验 取同一样品溶液于o，6，20，36，42，66h测定，记录峰面积，鱼腥草素钠峰面积6次测定值的RSD为0．9％，表明样品溶液在66 h内稳定。 2.4．4 重复性试验 取同一批样品(030301)3份，依法测 定，平均含量为100。6％，RSD为1．3％。 2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的供试品5份，递增添加鱼腥草素钠对照品溶液适量，依法制备和测定。鱼腥草素钠的平均回收率为99．6％，其RSD为1．0％。结果见表1。 3 样品测定 取鱼腥草素钠原料5批，依法制备供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液进样，用面积外标法计算，并用碘量法测定进行比对，结果见表2。 4 讨论 4.1 检测方法的选择 鱼腥草素钠易溶于热水，在水或乙醇中微溶，极性与对乙酰氨基酚相似，用其滴剂的反相检测方法，以C18(5 I．Lm，4．6mm×150mill)为固定相，不同比例的甲醇．醋酸与醋酸铵缓冲液(pH6。o)为流动相检测，均无峰检出。再将流动相改为不同配比的磷酸．水．甲醇，三乙胺．水．甲醇试验，仍未果。 参考了青霉素的反相离子对色谱法检测后，采用反相离子对色谱法，用短链固定相，C8(5 I．Lm，4．6 mm×150 mm)色谱柱，在流动相中加入反离子试剂四丁基溴化铵，有峰检出，但分离效果差；改加四丁基氢氧化铵，以2 mmol／L四丁基氢氧化铵溶液．甲醇(31：69)为流动相试验，峰型有改善，可保留时间很短(约3。5 min)，见图工(A)。将甲醇改为乙腈试验，效果良好，见图1(B)。试验了不同配比，最终以2 mmol／L四丁基氢氧化铵溶液．乙腈(64：36)为流动相，效果最好。 4．2 反离子试剂的用量与流动相的pH 流动相中反离子试剂四丁基氢氧化铵的用量应控制在1．6—2．2 mol／L。用量低于1．6 mol／L，由于亲和力太低，起不到反离子效果；用量超过2．2 mol／L时，pH值过大，达9。O以上，易损坏色谱柱。经试验，四丁基氢氧化铵的用量在2．0 mmol／L时，pH值为7．2，效果最好。 致谢 本文得到了上海市药物研究所王昕、上海市中药研究所吴佩颖、上海市药品检验所陈桂良等老师的帮助与指导，在此一并致谢!

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