黄芪及其制剂质量控制方法研究进展

查建蓬， 张嫡群， 王云志 (河北医科大学新药开发研究室，河北石家庄050017) 黄芪(Radix Astragali)为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．var．mongholicus(Bge．)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．)的干燥根，具有补气升阳，固表止汗，托疮生肌，利水消肿的作用，为常用中药之一。主要成分有黄芪皂苷、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素等。黄芪甲苷是黄芪皂苷的主要成分，具有抗炎、降压、镇痛、镇静、升高血浆中cAMP水平、促进小鼠再生肝 DNA的含量及促进免疫功能等生理活性。我国药典中收载的含黄芪的中成药有20种。黄芪、含黄芪的复方制剂以及生物样品的鉴别与含量测定一般以黄芪甲苷作为对照品进行质量检验。目前已报道的含量测定方法很多，包括高效液相色谱法、荧光法和薄层色谱扫描法等。鉴别方法一般采用传统的薄层色谱法。本文就近年来一些相关研究作一概述。 1 黄芪的鉴别 1．1 一般鉴别 黄芪及含黄芪的复方制剂，都以黄芪甲苷为对照品，采用薄层色谱法进行鉴别。供试品溶液的制备方法有多种方法，其繁简程度与制剂的剂型及成分复杂程度有关，较多的是采用正丁醇提取，也可配以超声加速样品的溶解。正丁醇提取液需用氢氧化钠溶液、氨试液或碳酸氢钠溶液洗涤若干次，然后蒸干，残渣用少量甲醇溶解。对于过于复杂的样品可用中性氧化铝柱或大孔吸附树脂柱进行纯化。薄层板为硅胶G板，展开剂及检测方法见表1。 1．2 指纹图谱 黄芪及含黄芪复方制剂的指纹图谱研究报道较少。张子忠等使用高效液相色谱法，采用指纹图谱技术建立了黄芪特征组分的表征与识别方法。色谱柱为Hypersil ODS(4．6mm x200 mm，5 Ixm)，流动相为甲醇一水梯度洗脱，检测波长为202 nm。随着研究的深入，相信黄芪及其复方制剂指纹图谱研究会有更多的报道。 2 含量测定方法 黄芪、含黄芪的制剂以及生物样品含量测定都以黄芪甲苷为指标成分进行测定，专属性较强。中国药典(2000版)采用薄层扫描法测定含量。该方法虽然具有简便快速、灵敏、选择性高和显色方便等特点，但也存在重现性、准确度差等缺点。近年来，随着高效液相色谱法的普及，特别是配有蒸发光散射检测器的高效液相色谱法(HPLC-ELSD)越来越广泛地应用于质量控制中。此外，还有荧光法和薄层色谱扫描法也有一些应用报道。 2．1 HPLC法 使用HPLC法测定黄芪及其复方制剂的含量大多采用反相色谱柱，紫外检测，但由于黄芪甲苷无特征紫外吸收(紫外最大吸收波长为200．8 nm)，必须以紫外末端吸收波长进行检测，检测波长为203 nm，为了降低本底吸收，流动相多采用乙腈．水系统。见表2。 2．1．1 UV检测的色谱条件 2．1．2 ELSD检测的色谱条件 黄芪及其复方制剂采用紫外末端波长检测，因干扰多，背景本底较高，检测灵敏度低，所以对样品的纯化和流动相要求很高。近期国家食品药品监督管理局下发国家药品标 准修订批件，将黄芪注射液含量测定由7LCS法改为HPLC．ELSD法。ELSD法能够较好地弥补UV检测的不足，确立了 HPLC-ELSD法作为国家法定标准在中药质量监测中的应用。近些年来，采用HPLC-ELSD法对不同产地、不同炮制方法炮制的黄芪药材及其中药制剂中黄芪甲苷的含量进行测定的报道很多。其主要HPLC条件见表3。 从表3中可以看出，黄芪甲苷的测定大多使用C18柱，流动相主要是乙腈．水系统。赵灵芝等““在实验中发现，在乙 腈一水系统中加入少量的四氢呋喃可明显改善黄芪甲苷的分离度和色谱峰形。 2．1．3 供试品溶液的制备 提取方法 多数文献中，供试品一般是先用甲醇提取，再蒸干提取液。残渣用少量水溶解，用正丁醇萃取，然后再碱洗。王传茂等L20J将提取液蒸干后，直接用水饱和的正丁醇溶解，再用碱洗，效果相同，简化了实验操作。钱广生等采用KOH碱化，正丁醇提取，再用NaH2P04溶液提取去除杂质。一般用正丁醇提取3次。黄芪甲苷即能提取完全。 从黄芪药材中提取黄芪甲苷，提取率随药材颗粒目数加大而增加，以60目提取率最高，因黄芪本身粗纤维较多，不宜采用过高的目数。 孙志云等比较了索氏提取器、直接加热回流和超声波提取黄芪甲苷的效果，认为用索氏提取器提取比后两种方法完全。李欢欣等D0]考察了不同提取时间和温度对黄芪中黄芪甲苷提取率的影响，结论是采用甲醇索氏提取，当水浴温度为80℃、提取时间为3 h时，提取效率最高。 提取液的纯化 马艳蓉等，采用D101大孔树脂柱净化黄芪提取液，当用水洗脱--*40％醇洗脱---70％醇洗脱时，发现能除去部分极性大的杂质，但黄芪甲苷随洗脱液丢失近30％；改用常温水洗脱，可将大部分水溶性杂质除去，黄芪甲苷损失可忽略，对保护色谱柱也有利。因此实验中，将40％醇洗脱步骤删除，保留水和70％乙醇洗脱。郭洪祝”采用C18小柱固相萃取的方式进一步纯化样品，所得的样品液干扰物少，重现性提高。 碱处理 在我国药典(2000年版)薄层扫描法测定黄芪甲苷中，前处理以氨试液洗涤，含量远高于末用氨试液处理。汪红等报道了黄芪中5种黄芪皂苷以黄芪皂苷Ⅳ(即黄芪甲苷)为母核，其糖链上连结的l-3个乙酰基，在用碱处理时，乙酰基易脱落成为黄芪皂苷Ⅳ。作者对以氨试液处理与未经氨试液处理的黄芪含量进行比较，表明后者黄芪皂苷的种类多于前者。黄芪中有效成分为总皂苷，将其转化为单一成分进行定量，既能对药材的综合品质进行评价，又能快速、简便操作，因此是可行的。若以氨试液洗涤，其余皂苷不易检测。作者在不以氨试液处理的前提下，对其中黄芪皂苷Ⅳ，Ⅲ，I的含量进行了测定。 有报道称L2”中药中的苷类等成分可以和体系中的金属离子形成络合物或分子之间相互作用，形成分子络合物。黄芪除含黄芪皂苷类成分外，还含有较多的氨基酸，多糖，黄酮，酚性化合物，以及多种微量元素。用氨试液处理可将黄芪甲苷从络合状态转为游离态。 田南卉等为了将黄芪醇类皂苷酯解为黄芪甲苷，采用2％氢氧化钾甲醇溶液回流处理供试品溶液。张爱华等“”对前处理过程中正丁醇萃取液用不同强度的碱液洗涤对含量的影响进行了比较，结果表明，用碱水洗涤与不用碱水洗涤对含量有明显影响，而且碱强度不同，含量也有差异。说明碱水的洗涤不仅仅是去除杂质，而且对黄芪甲苷含量测定起着至关重要的作用。 2．1．4 MS检测 MS检测在黄芪及其制剂上的使用未见报道。顾泳川等采用HPLC-MS法测定了大鼠尿中黄芪甲苷的含量并进行了尿药动力学的研究。 色谱柱：DIKMA公司DiamonsilTM Clo(5 um，4．6 mm x250 mm)，流动相：乙腈．水(40：60，v／v)，流速0．8 mE／rain,柱温箱25％。离子化方式：电喷雾离子化(ESI)。选择性离子检测(SIM)：黄芪甲苷807．5[M+Na]+保留时间为6．4min；地高辛(内标)803．5[M+Na]+，保留时间为5．5 min。传输电压90 V；干燥气流速：lo．5 L／min；雾化压力40 psig；于燥气温度：350℃；毛细管电压4000V。 黄芪甲苷在o．1一10μg/mL线性良好(r：0．9991．n=5)，最低检测限为10 ng/mL。高、中、低浓度的日内和日间变异系数均小于10％，平均回收率>90％。 2．2 荧光分析法 荧光分析法相对于HPLC法文献报道较少。杜鸣等利用在浓磷酸条件下，黄芪甲苷与香草醛反应的产物具有萤光特性，建立了香草醛荧光分光光度测定黄芪甲苷的方法。方法操作简便、专属性强、重现性好，样品处理简单、空白值低，测定多种类型的样品均无干扰。杜鸣等，还利用在硫酸条件下，黄芪甲苷与茴香酸反应的产物具有荧光特性，建立了相应的测定黄芪甲苷的方法。 茴香酸．硫酸荧光分光光度法测定血清中黄芪甲苷的含量技术参数及主要操作步骤： 取1．0旷L黄芪甲苷对照品o．05 mL于5 mL干燥的容量瓶中，加入2 s／L茴香酸溶液0．6 mL，再加入72旷LH2S04溶液O．8 mL，摇匀，置于60~C水浴中反应20 min，流水冷却至室温，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，在最大激发波长Ex320 nm，最大发射波长Em 387 rim下测定荧光强度值(If)。同时测定无黄芪甲苷对照品的试剂空白的荧光强度 值(Ⅱ真b)。 黄芪甲苷浓度与产物的荧光强度在O．2-2．0 mg／L与2．O一40m旷均呈线性关系。回收率98．8—102．4％。检出限：连续测定11次空白溶液的荧光值，求得标准偏差为0． 046。根据检出极限(D)：C(浓度)／If(荧光强度)x 30公式，算出检出极限为0．02 ms／L。 方法特点： (1)茴香酸测定黄芪甲苷的荧光分析法具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽、操作简便，尤其适用于血清中微量黄芪甲苷的分析。(2)在回收率实验中，分别对血清样品的萃取过程和测定过程的回收率进行了测定。9次萃取过程的回收率测定范围为86％一118％。(3)茴香酸溶液不稳定，应现用现配。(4)茴香酸与黄芪甲苷的反应是在无水条件下 进行的，体系中有水存在时会出现浑浊，并使荧光强度减小。 2．3 薄层扫描法(TLCS) 薄层扫描法是目前用于黄芪及其制剂质量控制的主要方法之一，具有简便快速、灵敏、选择性高和显色方便等特点，为了提高灵敏度和重现性，现多采用双波长扫描法。该方法文献报道较多，主要参数见表4． 从表4中可以看出，薄层扫描法一般使用硅胶G作薄层 板，展开剂使用较多的是氯仿．甲醇．水，配比大多是65：35：10，显色剂为10％硫酸乙醇。 王和平等采用TLCS法对8种黄芪饮片进行了质量分析，发现质量存在很大差异，黄芪甲苷的含量有些达不到《中国药典》的要求。 林朝展等采用TLCS测定了9个批次的黄芪市售药材中黄芪甲苷的含量，黄芪甲苷的含量在0．71—3．02 m#g之间，并发现广州市商品黄芪药材的质量存在较大差异。作者采用中性氧化铝去除杂质的方法，黄芪甲苷的平均回收率可达95．30％；而采用大孔树脂及活性炭柱吸附等方法去除杂质，回收率分别仅为83．76％和58．64％．3 结论 由于黄芪及其复方制剂成分复杂，光谱分析法应用较少，大多使用的是具有较强分离能力的色谱法。早期使用较多的是薄层扫描法，该法具有简便快速、灵敏、选择性高和显色方便等特点，但也存在重现性差等缺点。随着HPLC法的普遍使用，特别是E13D检测器的使用，解决了黄芪甲苷只有末端吸收的问题大大提高了测定的专属性，降低了共存物的干扰。

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