加减抵当汤防治大鼠胰岛素抵抗的疗效和机理研究
胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是肥胖症、2型糖尿病、脂质代谢异常、高血压、高胰岛素血症、冠心病等许多疾病发生的共同基础，所以对胰岛素抵抗的防治一直是近年来备受关注的课题。目前临床上治疗m多以西药为主，不仅有毒副作用，用久了还会产生“治疗失效”。因而，利用中医药优势，开发疗效显著、副作用少的改善胰岛素抵抗的中药制剂具有重要的现实意义。本实验通过选用高脂高糖饲料复制IR大鼠模型，用加减抵当汤进行干预，并用西药文迪雅进行对照，观察其相关指标的变化，并从分子水平检测肝脏胰岛索受体(InR．)、骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因表达的变化，为临床防治巩并阐明其作用机理提供客观依据。
1 材料与方法
1．1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠60只，体重(208．80±7．29)g，购自中国科学院上海实验动物中心，由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养及管理。60只雄性SD大鼠先适应性饲养1周，再随机分为6组，即正常组10只，模型组10只，加减抵当汤治疗大剂量组10只、中剂量组lO只、小剂量组10只，文迪雅对照组10只。
1．2 饲料基础饲料由浙江省医学科学院提供。高脂高糖饲料由浙江省医学科学院配制，其中基础饲料50％、熟猪油10％、蔗糖25％、蛋黄粉15％。
1．3 主要试剂及仪器葡萄糖试剂盒、甘油三酯试剂盒、胆固醇试剂盒、高密度脂蛋白试剂盒：上海申能德赛诊断技术有限公司。低密度脂蛋白试剂盒：上海复星长征医学科学有限公司。胰岛素放射免疫分析药盒：天津九鼎医学生物工程有限公司。RNA抽提试剂盒：Promega公司。RT—PER试剂盒：购自TAKARA公司。LBY／Nb全自动血液流变仪：北京普、利生集团产品。BCD一216E／B型低温冰箱：青岛海尔电器有限公司产品。凝胶成像分析系统：上海天能科技有限公司产品。Tpersonal型PER循环仪：Biometra公司产品。
1．4 药物 加减抵当汤组成：酒制大黄
按比例称取后，水煎后浓缩制成每毫升煎液含生药
1．5 处理方法正常组给予常规饲料同时灌服等容量的生理盐水，模型组和中药组给予高脂高糖饮食，模型组同时灌服等容量的生理盐水，中药组同时灌服大、中、小剂量的加减抵当汤中药煎剂(用量分别为
1．6 指标检测实验结束禁食12小时后，空腹取血。用葡萄糖氧化酶法测葡萄糖(FBS)；放射免疫法测胰岛素(FINS)；计算各自胰岛素敏感指数IsI=In［l／(FBS x FINS)]；脂酶法测胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL—C)、低密度脂蛋白(LDL—C)；全自动血液流变仪测定全血比黏度(WBV)、血浆比黏度(PV)。逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测肝脏和骨骼肌的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、肝脏胰岛素受体(InR)、骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的基因表达。
1．7 统计学方法本实验数据处理采用SPSSll．5统计软件。数据以(x±s)表示，采用方差分析对各组均数进行显著性检验。
2 实验结果
2．1 各组大鼠空腹血糖(FBS)、胰岛素(FINS)和胰岛素敏感指数(ISI)的变化。 见表1。
表1 各组大鼠FBS、FINS及lSI的比较(x±s)
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组别 例数 FBS (mmol／L） FINS (μIU／ml) lSI |
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正常组 10 5.19±0.37 16.22±2.95 -4.41±0.19 模型组 9 6.31±0.42** 26.26±3.55** -5.09±0.14** 文迪雅组 10 6.14±0.48 19.04±1.6△△ -4.75±0.13△△ 低剂量组 10 6.20±0.70 23.32±3.86 -4.94±0.20 中剂量组 9 6.15±0.76 19.41±1.80△△ -4.76±0.18△△ 高剂量组 10 6.16±0.52 22.86±1.80△ -4.93±0.11△ |
与正常组比较*P<0,05，**P<O．Ol；与模型组比较△P<0．05，△△P<0．Ol(下同)
2．2 各组大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL—C)的变化见表2。
表2 各组大鼠血脂情况比较(x±s，mmol／L)
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组别 例数 TC TG HDL—C LDL—C |
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正常组 10 2.73±0.26 1.26±0.34 0.83±0.15 1.64±0.28 模型组 9 4.57±0.16** 1.89±0.28**0.76±0.13 3.42±0.21** 文迪雅组 10 4.46±0.12 1.85±0.29 0.78±0.12 3.31±0.18 低剂量组 10 4.29±0.4 1.73±0.30 0.77±0.18 3.16±0.53 中剂量组 9 3.03±0.17△△1.33±0.34△△0.81±0.12 1.94±0.13△△ 高剂量组 10 4.16±O.47△ 1.48±0.34△ 0.79±0.19 2.84±0.68△ |
2．3 各组大鼠血液流变学指标的变化见表3。
表3 各组大鼠血液流变学变化的比较(x±s，mPa．s)
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组别 例数 WBV PV (高切) (中切) (低切) |
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正常组 10 4.18±0.32 6.63±0.86 11.76±0.92 1.29±0.12 模型组 9 6.72±0.59** 8.03±0.36** 15.82±0.35** 1.68±0.11** 文迪雅组10 6.55±0.79 7.60±0.45 15.79±0.25 1.67±0.12 低荆量组10 6.15±0.95 7.57±0.48 15.77±0.53 1.63±0.17 中剂量组9 4.83±0.78△△6.92±0.48△△12.80±0.66△△1.45±0.11△△ 高剂量组10 6.04±0.95△ 7.48±0.63△ 15.22±0.51△ 1.58±0.16△ |
2．4 各组大鼠InRmRNA、GLUT4mRNA和PPARγmRNA表达的比较见表4。
表4 各组大鼠肝脏InR和PPARγ骨骼肌GLUT4和PPARγ与PPARγ与β一actin光密度值的比较(x±s)
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组别 n 肝脏 骨骼肌 InR PPARγ GLUT4 PPARγ |
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正常组 10 0.92±0.03 0.86±0.02 0.95±0.05 0.71±0.01 模型组 9 0.76±0.02** 0.68±0.02** 0.72±0.01**0.45±0.02** 文迪雅组10 0.78±0.02 0.84±0.05△△ 0.75±0.02 0.68±0.04△△ 低剂量组10 0.77±O.02 0.67±0.04 0.74±0.02 0.46±0.03 中剂量组9 0.91±0.02△△ 0.68±0.03 0.88±0.03△△0.47±0.03 高剂量组10 0.81±0.03△ 0.68±0.03 0.77±0.22△ 0.46±0.02 |
从RT-PCH结果可知，与正常组相比，模型组InRmRNA、GLUT4mRNA和PPARγmRNA表达均明显降低(P<O．01)，各中药治疗组与模型组相比，中剂量组InRmRNA、 GLUT4mRNA的表达上升最显著(P<0．01)，高剂量组次之(P<O．05)，低剂量组无统计学意义，而各中药治疗组 PPARγmRNA的表达无明显变化。文迪雅组与模型组相比， InRmRNA,GLUT4mRNA的表达无明显变化，而PPARγmRNA的表达有明显升高(P<0．01)。
3 讨论
高脂高糖饮食致m动物模型和人类肥胖时的IR病因学相似，由于这一模型具有复制时间短、饲养方便、可靠性高、价格较低等特点，现已广泛应用于IR机理和治疗研究。高脂高糖饮食可以引起多种组织对胰岛素敏感性的降低，主要表现为外周组织对胰岛素刺激的葡萄糖处理能力下降及胰岛素对骨骼肌葡萄糖输出抑制能力降低。
对IR形成过程中的中医证候研究表明，气虚证贯穿IR形成的整个过程，而在珉的后期，以血瘀证等实证为主兼有气虚，且实证的m程度较虚证为著。因此，本研究以益气活血化瘀立法，通过经方抵当汤去虻虫，加黄芪，组成益气活血化瘀方，方中水蛭直人血络，善能破血逐瘀；桃仁活血化瘀；大黄泻热导瘀；黄芪益气补虚。四味组方，共成益气活血化瘀之剂。
对于胰岛素抵抗机理的研究，目前认为主要可分为受体前、受体水平和受体后抵抗。受体前水平，主要指胰岛素基因突变引起的胰岛素一级结构的改变和胰岛素生物活性降低，或胰岛素自身抗体的产生阻断胰岛素的生物活性。受体水平，主要指胰岛素受体基因突变造成的胰岛素受体生物合成减少；胰岛素受体向细胞内表面转运障碍，胰岛素受体降解加速等，均可致细胞表面胰岛素受体数目减少。另外，该基因突变还可造成胰岛素受体功能缺陷，主要表现为胰岛素受体与胰岛素的亲合性降低及胰岛素受体酪氨酸激酶活性的降低。对于受体后水平，因为胰岛素对葡萄糖的生理作用是胰岛素依赖GLUT4及许多关键酶(包括G激酶、糖原合成酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及丙酮酸脱氢酶)活化的结果，因而这些酶的结构或功能的缺陷均可引起IR。本实验选择受体和受体后水平研究中药对IR的影响，通过其lnR、 GUJT4基因表达的变化来探讨中药改善IR的作用机理。
马来酸罗格列酮(商品名文迪雅)属噻唑烷二酮类抗糖尿病药，是PPAR一γ的高选择性、强效激动剂，是目前临床上常用的胰岛素增敏剂，它通过降低胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性而有效地控制血糖。因此，本实验用文迪雅作为阳性对照药，以比较中药加减抵当汤的疗效及作用机理。
通过实验可知，加减抵当汤可有效地改善IR，其中中剂量组的疗效与文迪雅相当，同时，该方能降低血脂，降低血液黏稠度，而文迪雅则不具有该项功能。从RT—PCR的结果来看，加减抵当汤方能有效地上调InRmRNA、GIUT4mRNA的表达，而文迪雅则有效地上调PPAR一γmRNA的表达，但对 InRmRNA,GIUT4mRNA的表达无影响。可见，中药加减抵当汤方改善IR的机理与文迪雅不同，上调InRmRNA、GLUT
综上所述，加减抵当汤能有效地改善m，作用机理可能与上调InRmRNA、GLUT4mRNA的表达有关；同时，该方能降低血脂，降低血液黏稠度。在加减抵当汤的不同剂量中，以中剂量的疗效最佳，其改善IR的疗效与文迪雅相当。
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