高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析

当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。我国自2000-08国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注[2000]348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理。 l中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性“。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性。指纹图谱一般包含两层含义： 1．必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质；2．对于中药材，指纹特征还能反应出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异，差异越小说明药材(或成药)的稳定性越好。 2 HPLC用于中药指纹图谱的情况 文献分布表明，对中药指纹图谱的研究始于1993年，从1993—1999年共发表11篇，指纹图谱的研究基本处于未开发状态。而从2000年开始，研究中药指纹图谱的文献呈直线上升趋势，尤以近2年发展最快，与指纹图谱相关的文献报道就有上百篇，其中又以高效液相色谱法研究的指纹图谱居多，高效液相色谱以其应用的广泛性，检测的精确性成为控制中药质量最主要的检测方法。至今已有50种中药材，21种中成药运用HPLC法测定其指纹图谱并发表。 据文献统计，目前已对下列中药材运用HPLC进行了指纹图谱研究：枸杞、柴胡、新疆雪莲、夏天无、延胡索、白芍、白鲜皮、板蓝根、补骨脂、黄芩、赤芍、川东獐牙菜、川芎、刺五加、大黄、丹参、当归、地黄、茯苓、麻黄、甘草、葛根、马甲、红车轴草、红花、厚朴、怀牛膝、鸡血藤、金银花、绿衣枳实、密花石斛、牛膝、秦艽、人参、西洋参、忍冬、山银花、山楂、芍药、水蔓菁、乌拉尔甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、泽泻、栀子、西红花。中成药中采用HPLC进行指纹图谱研究的有：咳必安胶囊、灯盏花素注射液、白屈菜注射液、板蓝根颗粒、补肾方、川芎制剂、丹参注射液、丹参葡萄糖注射液、复方丹参片、参麦注射液、红花注射液、红景天注射剂、黄连解毒汤、脉络宁注射液、人参保健品、青银注射液、三七制剂、三七总皂苷注射液、肾康注射液、香丹注射剂、银杏叶注射剂。 指纹图谱可以对样品的产地、采收时间、加工方法、工艺流程等多方面通过化学成分的差异来反映中药材的种属差异、真伪鉴别、中成药的批次差异等等，从而达到控制中药质量的目的。在 HPLC指纹图谱的研究中，我们从以下几个方面进行分析和讨论。 2．1 供试品的制备 已研究的指纹图谱其供试品的制备，提取步骤多较为简单。如杜程芳等在白鲜皮药材指纹图谱研究中采用甲醇回流提取即得供试品，陶玲等在白屈菜注射液指纹图谱研究中直接将样品作为供试品进样。其目的主要是尽可能多的保留供试液中的化学成分，以期在指纹图谱中获得更多的信息。只有在针对特定一类的化学成分时，采用比较复杂的提取方法。如聂国朝在枸杞的指纹图谱研究中，针对类胡萝卜素采用了离心、萃取等步骤进行了试供品的制备。朱玲英等在大黄药材蒽醌苷元类成分的指纹图谱研究中，采用氯仿回流、乙醇回流、过氧化氢和盐酸回流，乙醚萃取等步骤进行供试品的制备。所以供试品制备的方法合理性也是决定指纹图谱最终稳定可靠的重要因素。 2．2标准品的选择 由于中药的许多化学成分未知，已制备的标准品数量还很有限，所以在指纹图谱中存在着谱峰无法确认是何化学成分的问题。一般来说，或加入内标物，以内标物的峰面积来比较其它各峰的相对保留峰面积。如张世轩等在测定灯盏花素注射液指纹图谱研究中，以黄芩苷为内标物加校正因子法来测定野黄芩苷；或将有效成分作为主要参比峰，并以此峰来比较相对保留峰面积。如苗爱东等在新疆雪莲指纹图谱研究中采用雪莲的有效成分紫丁香苷为参比峰。指纹图谱中代表其它化学成分的色谱峰只能以相对峰面积来进行相对含量分析，这就要求标准品的选择，既要色谱峰面积较大，又要选择有代表性的有效成分，这在指纹图谱中也是决定图谱准确性的一个问题。 2．3结果分析方法 结果分析方法可分为两种。一种是测定相对保留时间和相对峰面积，这也是目前采用最多的一种方法。在指纹图谱中，各化学成分的相对保留时间比较固定，可以作为定性和真伪鉴定的依据，但相对峰面积的比较则存在困难，各产地的药材同种成分的峰面积差异较大，很难对其进行定量分析。如苗爱东等“”在新疆雪莲指纹图谱研究中7个不同产地的雪莲各成分含量的相对峰面积比值差别较大。何春年等在葛根药材 HPLC指纹图谱研究中不同来源的葛根药材中8个共有峰的相对峰面积相差较大，提示葛根用药应在固定产地的前提下。另一种是聚类分析法，采用离差平方和(Ward’s)法，利用欧氏距离 (Euclidean)作为样品的聚类依据，以峰面积为样品谱图的特征值，将样品分为几类。计算样品与共有模式之间的相似度，即可对样品进行鉴定、分类和评价。如张克荣等在白芍HPLC指纹图谱相似度的分析中即采用此法从28个白芍药材将样品分为3类。李晓蒙等纠在秦艽药材HPLC指纹图谱研究中也采用了指纹图谱相似度计算法，得出10批药材有比较好的一致性，均可作为投料使用。这种分析法去除了人为的主观评价和误差，具备较好的客观性。从研究结果看，在种属鉴定方面具有一定的优势。 3讨论 3．1 在中成药的指纹图谱研究中，多是固定原料药材的质量、品种，检测不同批次的样品，从中找出共有指纹峰进行比较，如张世轩等[101在灯盏花素注射液测定中，选取了5批灯盏花素注射液的指纹图谱，来反映批间药品质量的稳定性。陶玲等在白屈菜注射液指纹图谱研究中选取了10批白屈菜注射液的指纹图谱。所以中药质量的稳定，必须建立在中药材性质稳定，采收加工产地一致的前提下，才能实现中药成品质量的稳定可靠。在制剂上，已发表的21种中成药指纹图谱研究中14种是注射剂，占到2／3的比例。分析原因一是由于国家逐渐规范注射剂的质量标准，要求注射剂提供中药原料、中间物、中药成品的指纹图谱；二是由于中药注射剂的制剂工艺要求严格，所含化学成分比其它剂型的成分相应较少，各批问由于工艺造成的成分差别较小，在固定了药材的前提下，研究的成药指纹图谱比较稳定，可以用于质量控制。 3．2 对于中药材的指纹图谱，多是采收几个产地的药材进行分析，如张克荣等在赤芍的指纹图谱研究中，测定了18个产地的赤芍药材，得出的指纹图谱能快速区分不同来源的赤芍药材。马翠英等在黄芩中黄酮类成分指纹图谱研究中对10个不同地区的黄芩进行了研究，为黄芩药材质量控制提供科学依据。由于中国幅原辽阔，药材的产地复杂多样，许多药材均为野生，很难对所有产地的药材进行细致完全的图谱采集分析，而生长、采收等情况的不同，也使药材的内在质量有很大的差别。这些都使指纹图谱用于中药材质量控制存在困难，从这点来看，中药材的规范种植管理势在必行，GAP的施行已迫在眉睫。 3．3 指纹图谱的重现性。由于实验仪器的差异，色谱柱效的影响，以及实验人员的操作误差，使得即使建立了～套指纹图谱，在不同实验条件下，色谱图中各成分的相对保留时间，会出现一定的偏差，这在一定程度上影响了指纹图谱的可比性。在供试品制备时，由于尽可能的简化了制备过程，造成进入色谱柱的成分较多，对色谱柱有一定的污染，影响色谱柱的寿命。这些问题都是指纹图谱研究中必须考虑的问题。 3.4与西药不同，大部分中药的化学成分不完全明确，其中已知的化学成分往往不能显示中药的全部疗效，因此采用化学分析的方法间接地控制中药质量存在着很多困难。目前还无法解析出指纹图谱中某一峰或某一段峰所代表的药理作用。单味药材的化学成分十分复杂，而复方中成药化学成分之间的交叉和相互影响更增加了分析结果的不确定性。缺少对照品和对照实验又无法保证获得标准指纹图谱实验条件的一致性，两者之间的差异可能使实验方法的重现性受到影响。 3.5中药指纹图谱目前还处于起步阶段，需要我们做大量的基础工作，只有当中药化学成分确定，并不断收集不同产地，不同采收期及不同加工方法的药材进行指纹图谱的研究，建立系统全面的药材指纹图谱库，经过十几年甚至几十年的研究积累，采用指纹图谱来控制中药质量的想法才能真正得以实现，中药质量控制 摘自《时珍国医国药》

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