生物技术在现代中药材生产领域的应用及应注意的问题（二）

2．用于中药材育种 利用当代育种和生物高新技术对现有中药材农家品种进行筛选、改良或创新，可达到提高产量与质量的目的。利用生物技术育种的方式有单倍体育种、多倍体育种、细胞无性系育种、体细胞杂交育种、远缘杂交育种等。基因工程可在短时间内实现药用植物某些遗传特性的定向改良。 (1)抗性育种 环境不适是限制中药材质量与产量的主要因素，采用基因工程手段增强药用植物对不良环境与病虫的抗性，对于提高产量、避免或减少农药污染等均有重要意义。①抗病毒基因工程育种：采用基因主要有向植物转移病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、核酸裂解酶基因、毒蛋白基因、抗病毒基因等，以病毒外壳蛋白基因和复制酶基因工程较为成功。②抗线虫基因工程育种：是防治线虫最为经济有效的方法，近年来利用转座子标记法和定位克隆法已从几种重要植物中克隆到2个抗线虫基因，即抗胞囊线虫基因 HslPRO－1和Cre3，在植物中使其得到表达均可提高抗线虫能力。③抗细菌病害基因工程育种：利用基因工程技术可同时把多个抗病性状导入感病植株，从而快速有效地获得抗病品种，现已克隆了昆虫裂解肽、溶菌酶等非植物抗菌蛋白，并在植物体内得到表达。④抗真菌病害基因工程有种：将外源抗真菌基因导人植物体，可有效防治真菌性病害，如粕几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦，就可抵抗赤霉病、纹枯病和根腐病等真菌性病害。⑤抗培措施来大幅度提高其含量难度很大。多数活性成分属于植物次生代谢产物，是在酶的作用下经过多个反应步骤而合成的，而酶的合成受基因调控。因此在掌握次生物质代谢分子机制的基础上，借助转基因技术来调节基因表达和酶合成，可培育出高活性成分含量或高品质品种。如绞股蓝具有苦涩味，口感不好，有人期望将甜蛋白Thaumatin基因转入绞股蓝并使之表达，以利用极甜的 Thaumatin蛋白遮掩其苦涩味。 3．应用于中药材种苗或种子工业化生产 通过药用植物组织或器官离体培养和形态建成，可使中药材种苗或种子得到大量快速繁殖，实现工业化生产。欧美国家试管苗的年产量在数千万株以上，且以每年7％～8％的速度增加。利用离体培养和体细胞胚胎发生制成的人工种子，可能在不远的将来实现产业化。 一些药用植物病毒非常严重，药材产量与质量大幅度下降，通过无病毒茎尖离体培养生产无毒苗，可有效地解决该问题。有的药用植物有性败育不能形成种子，采用无性繁殖时繁殖系数较低，如菊花、番红花等，在需要大面积种植时，可采取组织或器官培养实现快速繁殖。有些药用植物种子比较贵重，如西洋参，或由于药材市场行情看涨种子价格较高时，也可采取此种方式进行繁殖。对于那些繁殖用材同时属于药用部位的植物，实行快速繁殖可节约药材，如百部、百合、贝母、丹参等。快速繁殖对于保护渐危或濒危药用植物尤其重要。最近发展起来的封闭式强化快繁通风育苗系统和自动大规模培养系统，为优质药材种苗生产提供了有力保证。 4．在活性成分生产领域的应用 将中药材活性成分提取、分离、纯化研制新药，具有广阔的市场前景，部分品种已实现工业化生产并应用于临床。中药材活性成分含量在自然状态下往往很低，单纯从植物资源中获取，实际收率不高，很难适应批量生产，同时也易造成自然资源枯竭。生物技术的应用使这种局面得以改观。 (1)活性成分生产 活性成分的生产主要是通过植物组织或细胞培养及毛状根或冠瘿组织培养得以实现。①植物组织或细胞培养：人工培养条件下的药用植物组织或细胞进仍能进行次生代谢，其强度甚至大于原植物，从而产生与积累大量活性成分，为其快速生产创造了有利条件。组织培养时愈伤组织与亲本植株相比活性成分含量往往较低，可通过分化的根、茎、叶等器官培养来提高其含量，如利用长春花茎器官培养生产长春花灵、长春花质、长春花碱等。利用细胞培养生产活性成分最为常用，20世纪70年代日本利用细胞培养生产人参皂苷，现已采用大容量发酵罐，产出的皂苷组分及药理活性与亲本植物基本相同，皂苷含量为亲本植株的3倍以上。②毛状根与冠瘿组织培养：利用毛状根培养进行活性成分生产，增殖速度快，合成能力强，产物稳定，转化后遗传性能较稳定，并利于进行高产株系选择，如用长春花毛状根培养生产阿马碱、长春花质、长春花灵、长春花碱等，利用人参毛状根培养生产人参皂苷，利用紫草毛状根培养生产二羟基羟甲茂烯基萘二酮等。据不完全统计，药用植物毛状根培养已在26个科100多种植物上获得成功。对于那些由植物绿色器官合成的活性成分，可通过绿色毛状根培养来实现生产目的，如洋地黄含有强心苷，利用绿色洋地黄毛状根培养物不仅繁殖速度快，而且还使强心苷的产量提高。另外，有些活性成分不能在根中合成，可利用冠瘿培养达到目的，如用根癌农杆菌感染留兰香获得冠瘿瘤，以其组织进行离体培养产生的芳香油总产量虽然低于原植物叶片，但主要有效成分芳樟醇、乙酸芳樟醇的含量达芳香油总量的94％。 (2)活性成分合成促进与转化 在人工生产过程中，采取措施促进活性成分的合成与转化，可以提高产量、降低成本。①合成促进：活性成分是植物长期适应环境的产物，当遭受外界不良因素影响时，植物细胞即趋向于合成一些活性成分。在进行组织或细胞培养时，往往据此机制采取措施，刺激活性成分的生成与积累。一些生源物质如葡聚糖、糖蛋白、有机酸和真菌细胞壁材料等，以及非生源物质如重金属和某些能破坏细胞膜完整性的物质，都可以起到诱导植物细胞次生代谢活性加强的作用，这些因素被称为诱导子。如用人参寡糖作为诱导子，可使红花细胞培养物中α－生育酚含量提高3．5倍，同时使细胞生长率提高18．11％；在蜜环菌诱导子作用下，延胡索愈伤组织细胞培养物中的生物碱，尤其是具抗菌、消炎作用的生物碱，如延胡索乙素、黄连碱、海罂粟碱、原鸦片碱等的合成能力显著增强。通过生物技术手段，可阐明活性成分生物合成途径并找出其限速步骤，通过基因工程克隆此关键步骤催化酶的基因然后高效表达，也可达到提高含量的目的，如莨菪碱6-β-羟化酶是莨菪烷生物碱生物合成途径中催化莨菪碱合成6-β-莨菪碱、再经环氧化作用合成东莨菪碱的关键酶，以发根农杆菌作为载体，将天仙子胺 6-β-羟化酶转入到富含天仙子胺的颠茄发状根中，结果羟化酶活性增强，6-β-羟化莨菪碱含量比用野生型发根农杆菌诱导出来的发状根高，东莨菪碱的含量提高了5倍。②活性成分转化或产生新的活性成分：培养的植物细胞具有酯化、氧化、乙酰化、还原化、甲基化、羟基化、糖基化等多种生物转化能力，利用游离细胞、固定细胞和酶提取物进行生物转化，是获得活性更高、毒性更小或价值德国科学家利用洋地黄培养物具有的羟基化能力，已将β-甲基洋地黄毒苷转化为临床上使用的β-甲基地高辛。利用毛叶曼陀罗、长春花、蛇根木培养细胞进行氢醌转化为熊果苷的研究也已成功。

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