安徽药菊叶片直接再生植株技术的研究

菊花Chrysanthemum morifolium Ramat．是我国传统的大宗药材，已有3 000年的栽培史。历史上安徽省的亳菊、滁菊、贡菊以其品质优，药效好，产量高而最有名。但是由于长期以来菊花生产中多采用分根、扦插等无性繁殖方法，使得感染病毒严重。目前侵袭菊花的病毒不下10种，如菊花矮缩类病毒 CSC，烟草花叶病毒TMV等，而且随种植时间延长病情逐渐恶化，许多优良品种因此丢失。为解决安徽药菊的病毒病，保留优良品种基因，人们主要采用茎尖脱毒苗技术。近年来，以药菊叶片为外植体脱分化诱导愈伤组织，再分化形成再生植株，为叶盘法基因工程改造菊花的品质提供了技术平台。 但这一途径往往存在变异，因为在愈伤组织中，常可见到细胞染色体组成发生变化而表现出遗传上的不稳定性。若利用叶片再生植株，不经过愈伤阶段，可望保持亲本的遗传性状。而且叶片取材方便，来源广泛，均一性强，为此作者开展了安徽药菊叶片直接再生植株的研究工作，国内外尚未见相关报道。 1材料和方法 1．1材料 安徽药菊：亳菊、贡菊、滁菊脱毒苗叶片，经薛建平副教授鉴定为菊科植物药用菊花Chrysanthe—mllln m06folium的脱毒苗。 1．2培养基及培养条件 以MS为基本培养基，附加不同种类和浓度的植物生长物质，3．O％的蔗糖，用O．8％的琼脂固化， pH值5．8～6．O。光强2 000~3 000 lx，光照时间12 h·d－1，培养温度(25±1)℃。 1．3方法 剪取脱毒苗叶片，叶片以背接(叶片背面接种于培养基)和正接(叶片正面接种)2种接种方式。每个培养基中接种5个叶片，重复5瓶，25 d后统计直接再生不定芽叶片的频率。 2结果 2．1植物生长物质及接种方式对亳菊叶片直接再生植株的影响 将亳菊叶片以背接和正接2种方式接到添加了不同种类和浓度的植物生长物质的8种培养基中。在2种接种方式中，背接方式的直接再生植株率最高且成苗壮，而正接方式中叶片的叶柄和叶尖部向上卷曲，多表现为生长停滞，出现坏死现象较多。在正接及背接方式中，靠近叶柄的近基端再生能力明显高于叶顶部。以背接方式培养5 d后，叶片向下反卷生长，叶柄和叶尖端插入培养基中；7 d后，叶片仍保持原有绿色，面积和厚度未有明显变化，15 d后，M1，M3及M83种培养基中叶片主脉(少数在侧脉)上分化出1～2个小突起，这绿色突起一般在叶片主脉上呈密集的突起群，最早分化的绿色突起，逐渐长成圆锥状芽原体，形成不定芽。而M2， M4，M5，M6和M7中芽点多集中于叶柄基部膨大处，在叶片上直接再生成苗少且弱。其中M1培养基中诱导直接再生植株效果最好，成壮苗较多。以上结果表明，在低浓度的6-BA(O．1mg·L－1)及NAA(O．1 mg·L－1)中芽较粗壮，叶片舒展，且芽成单株状，易区分，随着6-BA浓度的增加，芽增殖率开始增加，因此 6-BA在亳菊直接再生植株中起主导作用。但是在 M6~M8中6-BA的单独使用并不利于植株的后期生长。 2．2植物生长物质及接种方式对滁菊叶片直接再生植株的影响 滁菊脱毒苗叶片以正、背接2种方式接种至8种培养基中，15 d后发现M1，M2，M7和M8培养基中开始有不定芽出现，25 d后其他培养基中也有芽点的分化，其中M1培养基对直接植株再生诱导效果较好。而且只有在背接方式中叶片有不定芽分化，正接方式中叶片仅在M7培养基中有芽点分化形成，但褐化死亡，未进一步发育形成幼苗。 2．3植物生长物质及接种方式对贡菊叶片直接再生植株的影响 贡菊脱毒苗叶片中以正、背接2种方式接种于8种培养基中，结果表明，25 d后只有在M1培养基中有芽点出现，再生率只有10％左右；而在M3， M4，M5，M8中均无明显现象。总的来看，和毫菊、滁菊相比，贡菊叶片直接再生植株过程多表现为生长停滞、分化慢，这可能与其品种的基因型有关。 3讨论 在正接及背接方式中靠近叶柄的近基端再生能力明显高于叶顶部，造成这种现象的原因可能是维管束在叶中的分布密度不同。维管束是激素在叶内运输的主要通道，维管束周围的薄壁细胞较容易吸收到培养基中生长调节物质，从而促进了此处薄壁细胞的生长分化。基部的维管束分布较密，分化能力较高。这也是为什么离体叶片培养，不定芽多是从叶脉上分化出来的原因。 叶片背接方式中芽的分化率远远高于正接方式，这可能与叶片极性有关。当叶片背接时，叶片向下反卷生长，叶柄和叶尖端插人培养基中，叶片可以从培养基中吸收更多的养分；而且叶背面气孔多，也有助于水分和养分的吸收。但当叶片正接时，叶片向上反卷生长，叶柄和叶尖端不能接触培养基，使得叶片无法从培养基中吸收养分，从而造成生长停滞，出现坏死现象较，芽分化率低。在试验中还发现对叶片直接再生植株来说，叶龄也是一个重要因素，叶龄过老，再生困难；叶龄过小的嫩叶往往培养后易坏死。因此应该选择植株上部的2～3片幼龄健壮叶作培养材料，则有利于直接再生植株。 从对亳菊、滁菊和贡菊的比较研究中发现，不同品种间再生能力存在着很大差异。全息胚学说的观点认为，生物体由处于不同发育阶段的具有不同特化程度的全息胚组成，对于诱导不定芽的发生，一定浓度的6-BA是不可缺少的，植物的枝、叶都是特化了的全息胚。从叶中重新诱导芽，也就是全息胚的重演性，重演性需要全息胚分化促进剂。6-BA可能就是一种全息胚分化促进剂，其效应因浓度而异。亳菊、滁菊和贡菊由于基因型的不同，全息胚的重演可能需要不同的全息胚分化促进剂和培养条件。我们初步建立了亳菊和滁菊叶片直接再生植株的培养基，以MS+6-BA 0．1 nlg·L－1+NAA 0．1 mg·L－1较为适宜，为今后利用遗传转化技术培育药菊新品种提供了技术支持，但贡菊的再生体系仍有待进一步研究。

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