丹参酮II A对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织及血清中N0含量及NOS、iNOS活性的影响

　　一氧化氮(NO)是机体内重要的信使分子和效应分子，为神经传递、血管舒张、调节神经功能的内源性介质，与神经系统的生理和病理过程关系密切，而一氧化氮合酶(NOS)是N0生物合成的限速酶。丹参为唇形科鼠尾草属植物，具有活血化瘀、宁心安神等功效，目前在缺血性脑血管病的治疗中广为应用。有研究发现，丹参能下调缺血所致的NOS表达，使N0合成减少，减轻缺血性脑损伤。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究丹参酮II A(Tanshinone II A，Tan II A)对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织和血清中N0含量和NOS、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性变化的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制。   

　　1材料与方法   

　　1．1动物    健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共40只，体质量(250-30)g，广西医科大学动物实验中心提供。   

　　1．2分组及给药    将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan II A低剂量组及Tan IIA高剂量组，每组10只。TanIIA低剂量组(15 m9／kg)和高剂量组(30 m9／kg)均于术前连续灌胃给药3d，。每日1次，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。第3日给药后l h建立局灶性脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。

　　1．3造模

　　参照文献[3]方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。采用石蜡线栓，直径约0．27 mm，插入深度约l8 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。冲经功能缺陷评分按照Longa等评分标准，分数在1～3分为模型成功。

　　1．4 HE染色病理形态学观察

　　再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～ll mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5 tm。连取5张作HE染色，观察病理形态学改变。

　　1．5指标检测

　　再灌注24 h，大鼠均内眦取血，置于干燥试管中，离心，然后将上清液置于干净EP管中，低温保存，用于测定N0、NOS和iNO$。取血完毕后立即将各组大鼠断头取脑，冰盘上快速取一侧大脑皮层，用冰冷生理盐水冲洗掉血液，滤纸吸干水分，于低温环境下称重，置于含有冰冷生理盐水的玻璃匀浆器中(匀浆器放入冰浴中)制成质量分数为10％的脑组织匀浆，然后放置于低温离心机中，4℃离心，取上清液，低温冰箱中保存，用于测黢备指标。

　　1.6统计学方法

　　数据处理采用SPSSll．5统计软件进行运算，结果以x+s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。

　　2结果

　　1丹参酮II A对脑组织病理学改变的影响

　　假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显。缺血再灌注组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失或结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆伊红；部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶。Tan IIA不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组比较。缺血改变更轻。

　　3讨论

    　N0是生物体内重要的信使分子和效应分子，具有神经介质和调质的功能，广泛参与体内生理和病理活动。在脑缺血性损伤过程中，依据缺血及再灌注时间段及产生N0的细胞类型和产生N0过程等条件不同，N0可能发挥损伤或保护的双重作用。NOS作为N0合成的关键酶，可分为三种类型：第l种是神经元型(nNOS)，第2种为内皮结构型(eNOS)，它们的激活均依赖于钙离子和钙调蛋白的作用。第3种为诱导型，可由炎症因子、内毒素等诱导激活，iNOS作用时间长，可催化生成大量N0。近年研究表明，在脑缺血再灌注损伤过程中，NOS是决定N0双重作用的关键。脑缺血后NOS活性在缺血各时期均有增高，但在缺血损伤的不同阶段，不同类型的NOS发挥不同的功能作用。脑梗死超早期(<2 h)，eNOS活性升高，产生NO在局部扩张脑血管，增加脑血流，发挥脑保护作用，但超过2 h则作用消失。脑梗死早期(2～6 h)，nNOS产生大量N0发挥毒性作用，当脑梗死晚期(>6 h)，iNOS产生的N0可加剧谷氨酸毒性，导致迟发性神经元损伤，尤其iNOS与钙调蛋白结合紧密，产生大量的N0，更加剧了迟发性神经元死亡。本实验结果显示，脑缺血90 min再灌注24 h，缺血再灌注组大鼠脑组织和血清中N0含量、NOS及iNOS酶的活力均明显上升，提示N0的增加可能来源于nNOS和iNOS的活性增高，而升高的N0与NMDA受体结合使大量Ca2+通道开放，胞浆内ca2+明显升高，引起细胞内钙超载，促发损伤级联反应。随着缺血再灌注损伤的发展和炎细胞的浸润，以及肿瘤坏死因子Q、白细胞介素一B等细胞因子表达增加，可诱导iNOS产生增多，从而介导神经毒性作用，导致神经元进一步损伤。

  　  胡氏等研究发现，Tan II A能减小缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积。本研究结果也显示，脑缺血再灌注损伤给予TanIIA治疗也可明显减轻缺血病理损害，高剂量Tan IIA的保护效果更显著，表明Tan II A对缺血再灌注脑损伤有保护作用。我们的研究还显示，Tan IIA能减少脑组织和血清中N0的含量、降低iNOS和NOS活力，表明Tan IIA抑制N0作用可能主要是通过降低iNOS活性而实现的。

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