[男性不育检查]精子活动力分析电脑辅助系统
核心提示： 一、概述
近年来有关精子浓度、活动力和运动特征的自动分析系统被称为计算机辅助精液分析系统（computer-assisted semen analysis，CASA）已在国内外广
近年来有关精子浓度、活动力和运动特征的自动分析系统被称为计算机辅助精液分析系统（computer-assisted semen analysis，CASA）已在国内外广
一、概述
近年来有关精子浓度、活动力和运动特征的自动分析系统被称为计算机辅助精液分析系统（computer-assisted semen analysis，CASA）已在国内外广泛应用，从而开创了男性学研究的一个新领域。为了把精液分析与精子运动特征的特殊分析区分开来，后者又被称为计算机辅助或计算机自动化精子活动力分析系统（computerassisted，orcomputer-automated，spermmotilityanalysis，CASMA），因为 CASMA 并不一定要与精液分析联系起来。但这类术语的内涵并非十分明确，尤其是因为忽视了其他一些情况，如：① 在非精液分析条件下用 CASA 研究人类精子（例如经洗涤的精子浓度和活动精子百分比）；② 任何观察条件下 CASA 用于非人类精子检测；③ 分析精子的其他方面，如形态学。
在美国已有市售的精液 /精子活动力分析系统，前期主要有以下几种：CellSoft（系统2000和 3000），HT-M2030和 CTS-30系统。此外，还有德国生产的 VICOS-SPERM 和美国生产的 LABSCAN VI。另有一些正在研究开发的分析系统，也即将推向市场。尽管 CASA /CASMA系统（如数码图像分析）操作的基本原理相同，但在所用的光学系统、图像获取技术、精子识别技术、轨迹重建计算方法、运动分析计算方法以及数据分析等方面都存在较大差别。显然，要使用这些方法或是利用其中一种方法获得数据，都必须熟悉精子运动分析和特殊分析的基本原理。本节将对某些比较重要的特征和差别作一些讨论。使用者还应认真阅读用户指导手册，并必须记住这些系统的软件乃至硬件常常还会有明显变化和改进。
二、精子碰撞的影响
如果两个游动的精子相互碰撞，将会干扰各自的运动，其影响是十分显著的。同样，如果游动精子与不动精子、较大的精子碎片或其他细胞（如白细胞）相撞，也会产生类似的后果。事实上，因为精子尾部的摆动范围至少与由 ALH 测得的轨迹一样宽，改变精子的运动并不一定发生实际上的碰撞。这是运动分析中一个难于解决的问题。在 Cellsoft系统中，当一个物体的最大似然环（circle ofmaximun likelihood），即下一个可能位置的区域，包含被识别为子的第二个物体时，Cellsoft就会停止追踪这个物体，该环的半径依赖于 Cellsoft参数中设定的最大速度，基本上就是精子能在摄像系统的图像之间移动的最大期望距离。如果两个运动物体的轨迹重叠，那么两者在分析中均予剔除。这是避免因精子碰撞而导致轨迹变形可能性的一种安全方法。如果轨迹太短（该系统参数中设定的最低要求是 15 个图像或0.5s），就不能作样品的运动特征分析。而 HT-M2030与 CTS-30系统均不排斥碰撞，从而也不易受精子浓度的影响（详见后述）。至于其精子样品的平均运动特征是否摆脱了明显的偏倚，仍有待进一步证实。总的来说，我们尚不清楚碰撞对于单个精子的运动特征的实际影响。
三、浓度依赖性
Cellsoft系统轨迹计算方法的一个重要的问题受浓度的影响很大。最佳的精子运动分析只能适用于精样浓度小于 40×106精子 /mL 的精液，且设定速度最高为 200μm /s。精液浓度过高会造成轨迹在运动分析过程中失踪的可能性增加，而且不但受到精子浓度的影响亦受活动精子比例及其速度分布的影响。如果最大设定速率过高，例如对于洗涤过的精子（通常 300～ 400μm /s）或制备液过深，则该系统可进行运动分析的最大精子浓度会降低。
四、商用 CASA /CASM A 系统
（一）Cellsoft2000
Cellsoft2000基本上是一种简化型和实用型的 Cellsoft3000，以适合用临床应用，其基本的精液特征（如精子浓度和活动力分析）功能与 Cellsoft3000相同，但后者还可提供定性的前向运动速率。由于 Cellsoft2000 不能提供精子运动特征指标，因此可以认为该系统仅具有CASA 功能而没有 CASMA 功能。Cellsoft2000作为一种精液自动分析系统，其准确度和精密度与 Cellsoft3000相同。
（二）Cellsoft3000
1.基本功能 Cellsoft3000的基本结构包括：一个安装在奥林帕斯（Olympus）BH2-S显微镜上的黑白摄像机，2个录像监测器（一个用来显示真实的录像图形，另一个则用于对图像进行数码化处理），一个选择性 VCR，一台 386 微机（建议再配一个台协处理器）和一台点阵打印机。可加热的显微镜载物台对于精子运动分析研究也是必需的。
在 Cellsoft3000上已成功地使用了 Makler和 PetroffHausser计数池以及普通的显微镜载玻片，但在使用 Horwell计数池时，因其基底部太厚，所获图像令人失望。
该系统具有 CASA 和 CASMA 双重功能，既可以适用于照相机也适用于录像机。目前虽然已有推荐使用的该系统参数，但建议各使用者通过与标准精液分析方法进行比较来决定自己的最佳设定（见本章第六节）。
2.CASA 的功能 Cellsoft系统的精确性，即对同一样品的两次测定对同一录像带的相同部分作重复分析，其一致性良好。关于该系统与传统精液分析方法相比的精确性，文献中的意见不一。造成这种不一致的原因包括很多方面的潜在误差。
首先，Cellsoft使用的是 Malkler计数池。如上所述（见本章第二节）利用该计数池可能产生精子浓度的明显误差。Cellsoft系统测定的精子浓度值与由血细胞计数器获得的值相比有相当大的差异。一个值得注意的主要问题是，在评估 Cellsoft（及其他 CASA 系统）自动测定精子浓度和活动精子百分比的可靠性时，多数人可能均使用了不适当或是不精确的统计程序来进行数据分析（见本章第六节）。
其次，在数码化图像分析技术方面存在两类潜在的误差：① 是否能正确识别视野中的所有精子；② 是否能正确识别活动精子与不活动精子。第一类误差的产生是由于聚集成团的精子（常见于临床送检的标本中）计数时被误认为单个精子图像，以致根据 CASA 系统中设定的参数大小范围，因精子头部太大而被剔除于分析对象之外，即使精子团中只有 2～3个细胞也被误认为单个精子，如果其面积超过了所设定的最大细胞体积范围（通常是 25pixel），分析时就自动被剔除。这样会降低精子的浓度。因为大多数不活动的精子都是密集成团的，其结果是增加活动精子的比例。此外，任何细胞碎片或是类似大小的其他细胞以及精子头的折射表象，在 CASA 系统中均被视为不活动精子进行计数。关于活动与不活动精子的问题，Cellsoft定义一个活动的物体，应在最初 4个图像中显示出超过预先设定的阈值的曲线速度。目前，多数学者用 10μm /s作为 VCL 活动力阈值。30Hz时，这相当于在 0.33μm图像间的真实运动，则要求物体的中心在图像中仅移动 0.5pixel，从而在数字化摄像的初始阶段，少量的精液流或活动精子之间的碰撞或相互干扰很容易产生运动物体的假象，显然这将进一步增加精液中活动精子的比例。已有证据显示，规定精子活动力必须在大量图像中持续存在较高的阈值速度（20μm /s），这样有助于改善 Cellsoft系统在测定活动精子比率与精子浓度方面的功能。
若男性患者精液的精子浓度较低时，CASA 系统会把折射的细胞碎片误认为是精子，因此，在报告结果时，此类精样的精子浓度显著增加。
3.CASMA 的功能 应用 Cellsoft根据重建轨迹所测得的有关精子运动分析的参数值是准确的。但当用平均值来反映样品中的所有活动精子的运动特征时，应予以特别关注。研究该问题时发现，在精子运动速度分布的较低一端（10～ 20μm /s），常常存在一个明显的峰值，有时活动精子的比率高达 30% ～ 40% 。检查 Cellsoft输出的个体精子数据显示，许多运动速度很低的精子其 VSL 和 LIN 值极低。尽管其 VCL 值高于 CASMA 系统的补充阈值（10μm /s），以致被认为是活动精子，但它们显然并不表现出任何方向性的运动，最好通过测定精子前向活动力的 VSL 阈值，从受检精子中去除这些无前向运动的精子，这样确实能为受检精子群提供更具有代表性的平均运动特征。有鉴于此，对受检精样而言，有必要确定前向性活动力的定义以识别其中那些真正具有潜在功能的精子。在上述工作的基础上，研究人员正在开发一种 Cellsoft的新版本，从而使用者可以确定 VSL 阈值。
4.文件和辅助设备 标准的 Cellsoft3000系统输出的结果包括一个简要报告和一份精子个体数据报告。用于这两个报告的数据能够在完成分析后立即储存到磁盘上。
许多有经验的用户发现 Cellsoft缺乏可创建由用户限定的若干系统参数系列的功能，且这些参数可从菜单上选取，不必通过 Cellsoft系统中已设定的参数选择功能来改变各自的参数值。现已开发了一种使用简便的 MS-DOS批文件的辅助设备以增加上述功能。
Cellsoft拥有的另一功能是储存轨迹数据文件。这些文件对于每一个精子轨迹均能提供每个图像中精子头部中心点的 X、Y 坐标值，以致这些文件还能用研究模块（research mod-el）进行检测和编排处理。
5.研究模块 研究模块是用来追踪数据库中有关文件资料，以深入研究精子运动时间和方向的一组程序。单个细胞或成组细胞的运动可以作为时间的函数进行分析，该函数可提供的信息包括：加速度运动方向的改变及其改变速度，以及 VCL 与 ALH 特征等的详尽分析。Cellsoft的这一组附加程序对从事精子运动的研究人员来说是一种很有用的研究工具，但目前如果不使用一种昂贵的外部统计软件包，还缺乏轨迹分类处理功能，而 HT-M2030系统则已具备此功能。
6.超活跃模块 一种高度活跃但又非向前的运动类型（犹如舞蹈），称之为超活跃（hy-peractivation）现象，这种现象看来在常温哺乳动物的精子中普遍存在。在精子的鞭毛水平上，其确切的超活跃的运动类型因种属而异，某些种属还具有双相性质。例如：家兔精子的非前向性"舞蹈"样的运动类型是与其前向性"冲刺"样运动类型相互交错的。起初，并不认为人类精子具有真正的超活跃运动类型，但已发现在获能介质中人类精子的活动类型显示了某些超激活变化。现在则能够应用 Cellsoft系统基于精子运动特征来客观地分析人类精子的超活跃状态。这项工作成为一项商业专利的目标。直接作为附加 Cellsoft3000 系统的"超活跃模块"而被开发出来。
（三）HT-M2030
1.基本功能 基本的 HT-M2030是一个兼有 CASA 和 CASMA 功能的严密系统，包括一个具有温度控制功能的标本台，完整的光学和成像系统以及一台微机。多功能监视器，既可供用户进行系统设置和操作，又可用作成像系统、轨迹观察和编辑显示器以及结果显示器。该系统由 8个按钮控制，其中 3个控制标本台，另外 5个的功能由软件控制。另外还可外接键盘用于输入患者 /样品的信息。硬拷贝输出是由热导打印机提供的，但也可外接一台点阵打印机（或轨迹测绘器）。
在正常条件下，显然可以使用外接 VCR 甚至显微镜，但 HT-M2030系统可进行"实时"分析和结果输出。分析结果和数据也可以输送到系统的电脑中贮存以供随后复习和查询。
对于人类精子，相差光学显微镜即可提供最佳结果，但若应用深度为 200μm［最佳浓度（0.05～ 2.0）×106/mL］的玻璃毛细管或套管时，必须使用红外系统。对于浓度更高的精子悬液和全组分精液，HT-M2030能使用普通显微镜制备物以及 Makler、Horwell或 Petroff-Hauss-er计数板。使用这几种计数板时，最大可分析精子浓度取决于内部光学系统的放大倍数。
HT-M2030内部影像系统的一个优点是其图像频率为 30 Hz（FAST/SPLIT 系统）在世界各地均能通用。使用 220～ 240V，AC 电源 50Hz的交流电时，既可连接 NTSC 标准的录像机（模型 A：与当地买到的 LCR 或照相机不兼容）连用，也可与 PAL/SECAM 兼容的录像系统（模型 B）连用在 FAST/SPLIT 条件下可数码化的最大轨迹点为 20（2/3s）。这在某些情况下可能是一个缺点。
近年来有关精子浓度、活动力和运动特征的自动分析系统被称为计算机辅助精液分析系统（computer-assisted semen analysis，CASA）已在国内外广泛应用，从而开创了男性学研究的一个新领域。为了把精液分析与精子运动特征的特殊分析区分开来，后者又被称为计算机辅助或计算机自动化精子活动力分析系统（computerassisted，orcomputer-automated，spermmotilityanalysis，CASMA），因为 CASMA 并不一定要与精液分析联系起来。但这类术语的内涵并非十分明确，尤其是因为忽视了其他一些情况，如：① 在非精液分析条件下用 CASA 研究人类精子（例如经洗涤的精子浓度和活动精子百分比）；② 任何观察条件下 CASA 用于非人类精子检测；③ 分析精子的其他方面，如形态学。
在美国已有市售的精液 /精子活动力分析系统，前期主要有以下几种：CellSoft（系统2000和 3000），HT-M2030和 CTS-30系统。此外，还有德国生产的 VICOS-SPERM 和美国生产的 LABSCAN VI。另有一些正在研究开发的分析系统，也即将推向市场。尽管 CASA /CASMA系统（如数码图像分析）操作的基本原理相同，但在所用的光学系统、图像获取技术、精子识别技术、轨迹重建计算方法、运动分析计算方法以及数据分析等方面都存在较大差别。显然，要使用这些方法或是利用其中一种方法获得数据，都必须熟悉精子运动分析和特殊分析的基本原理。本节将对某些比较重要的特征和差别作一些讨论。使用者还应认真阅读用户指导手册，并必须记住这些系统的软件乃至硬件常常还会有明显变化和改进。
二、精子碰撞的影响
如果两个游动的精子相互碰撞，将会干扰各自的运动，其影响是十分显著的。同样，如果游动精子与不动精子、较大的精子碎片或其他细胞（如白细胞）相撞，也会产生类似的后果。事实上，因为精子尾部的摆动范围至少与由 ALH 测得的轨迹一样宽，改变精子的运动并不一定发生实际上的碰撞。这是运动分析中一个难于解决的问题。在 Cellsoft系统中，当一个物体的最大似然环（circle ofmaximun likelihood），即下一个可能位置的区域，包含被识别为子的第二个物体时，Cellsoft就会停止追踪这个物体，该环的半径依赖于 Cellsoft参数中设定的最大速度，基本上就是精子能在摄像系统的图像之间移动的最大期望距离。如果两个运动物体的轨迹重叠，那么两者在分析中均予剔除。这是避免因精子碰撞而导致轨迹变形可能性的一种安全方法。如果轨迹太短（该系统参数中设定的最低要求是 15 个图像或0.5s），就不能作样品的运动特征分析。而 HT-M2030与 CTS-30系统均不排斥碰撞，从而也不易受精子浓度的影响（详见后述）。至于其精子样品的平均运动特征是否摆脱了明显的偏倚，仍有待进一步证实。总的来说，我们尚不清楚碰撞对于单个精子的运动特征的实际影响。
三、浓度依赖性
Cellsoft系统轨迹计算方法的一个重要的问题受浓度的影响很大。最佳的精子运动分析只能适用于精样浓度小于 40×106精子 /mL 的精液，且设定速度最高为 200μm /s。精液浓度过高会造成轨迹在运动分析过程中失踪的可能性增加，而且不但受到精子浓度的影响亦受活动精子比例及其速度分布的影响。如果最大设定速率过高，例如对于洗涤过的精子（通常 300～ 400μm /s）或制备液过深，则该系统可进行运动分析的最大精子浓度会降低。
四、商用 CASA /CASM A 系统
（一）Cellsoft2000
Cellsoft2000基本上是一种简化型和实用型的 Cellsoft3000，以适合用临床应用，其基本的精液特征（如精子浓度和活动力分析）功能与 Cellsoft3000相同，但后者还可提供定性的前向运动速率。由于 Cellsoft2000 不能提供精子运动特征指标，因此可以认为该系统仅具有CASA 功能而没有 CASMA 功能。Cellsoft2000作为一种精液自动分析系统，其准确度和精密度与 Cellsoft3000相同。
（二）Cellsoft3000
1.基本功能 Cellsoft3000的基本结构包括：一个安装在奥林帕斯（Olympus）BH2-S显微镜上的黑白摄像机，2个录像监测器（一个用来显示真实的录像图形，另一个则用于对图像进行数码化处理），一个选择性 VCR，一台 386 微机（建议再配一个台协处理器）和一台点阵打印机。可加热的显微镜载物台对于精子运动分析研究也是必需的。
在 Cellsoft3000上已成功地使用了 Makler和 PetroffHausser计数池以及普通的显微镜载玻片，但在使用 Horwell计数池时，因其基底部太厚，所获图像令人失望。
该系统具有 CASA 和 CASMA 双重功能，既可以适用于照相机也适用于录像机。目前虽然已有推荐使用的该系统参数，但建议各使用者通过与标准精液分析方法进行比较来决定自己的最佳设定（见本章第六节）。
2.CASA 的功能 Cellsoft系统的精确性，即对同一样品的两次测定对同一录像带的相同部分作重复分析，其一致性良好。关于该系统与传统精液分析方法相比的精确性，文献中的意见不一。造成这种不一致的原因包括很多方面的潜在误差。
首先，Cellsoft使用的是 Malkler计数池。如上所述（见本章第二节）利用该计数池可能产生精子浓度的明显误差。Cellsoft系统测定的精子浓度值与由血细胞计数器获得的值相比有相当大的差异。一个值得注意的主要问题是，在评估 Cellsoft（及其他 CASA 系统）自动测定精子浓度和活动精子百分比的可靠性时，多数人可能均使用了不适当或是不精确的统计程序来进行数据分析（见本章第六节）。
其次，在数码化图像分析技术方面存在两类潜在的误差：① 是否能正确识别视野中的所有精子；② 是否能正确识别活动精子与不活动精子。第一类误差的产生是由于聚集成团的精子（常见于临床送检的标本中）计数时被误认为单个精子图像，以致根据 CASA 系统中设定的参数大小范围，因精子头部太大而被剔除于分析对象之外，即使精子团中只有 2～3个细胞也被误认为单个精子，如果其面积超过了所设定的最大细胞体积范围（通常是 25pixel），分析时就自动被剔除。这样会降低精子的浓度。因为大多数不活动的精子都是密集成团的，其结果是增加活动精子的比例。此外，任何细胞碎片或是类似大小的其他细胞以及精子头的折射表象，在 CASA 系统中均被视为不活动精子进行计数。关于活动与不活动精子的问题，Cellsoft定义一个活动的物体，应在最初 4个图像中显示出超过预先设定的阈值的曲线速度。目前，多数学者用 10μm /s作为 VCL 活动力阈值。30Hz时，这相当于在 0.33μm图像间的真实运动，则要求物体的中心在图像中仅移动 0.5pixel，从而在数字化摄像的初始阶段，少量的精液流或活动精子之间的碰撞或相互干扰很容易产生运动物体的假象，显然这将进一步增加精液中活动精子的比例。已有证据显示，规定精子活动力必须在大量图像中持续存在较高的阈值速度（20μm /s），这样有助于改善 Cellsoft系统在测定活动精子比率与精子浓度方面的功能。
若男性患者精液的精子浓度较低时，CASA 系统会把折射的细胞碎片误认为是精子，因此，在报告结果时，此类精样的精子浓度显著增加。
3.CASMA 的功能 应用 Cellsoft根据重建轨迹所测得的有关精子运动分析的参数值是准确的。但当用平均值来反映样品中的所有活动精子的运动特征时，应予以特别关注。研究该问题时发现，在精子运动速度分布的较低一端（10～ 20μm /s），常常存在一个明显的峰值，有时活动精子的比率高达 30% ～ 40% 。检查 Cellsoft输出的个体精子数据显示，许多运动速度很低的精子其 VSL 和 LIN 值极低。尽管其 VCL 值高于 CASMA 系统的补充阈值（10μm /s），以致被认为是活动精子，但它们显然并不表现出任何方向性的运动，最好通过测定精子前向活动力的 VSL 阈值，从受检精子中去除这些无前向运动的精子，这样确实能为受检精子群提供更具有代表性的平均运动特征。有鉴于此，对受检精样而言，有必要确定前向性活动力的定义以识别其中那些真正具有潜在功能的精子。在上述工作的基础上，研究人员正在开发一种 Cellsoft的新版本，从而使用者可以确定 VSL 阈值。
4.文件和辅助设备 标准的 Cellsoft3000系统输出的结果包括一个简要报告和一份精子个体数据报告。用于这两个报告的数据能够在完成分析后立即储存到磁盘上。
许多有经验的用户发现 Cellsoft缺乏可创建由用户限定的若干系统参数系列的功能，且这些参数可从菜单上选取，不必通过 Cellsoft系统中已设定的参数选择功能来改变各自的参数值。现已开发了一种使用简便的 MS-DOS批文件的辅助设备以增加上述功能。
Cellsoft拥有的另一功能是储存轨迹数据文件。这些文件对于每一个精子轨迹均能提供每个图像中精子头部中心点的 X、Y 坐标值，以致这些文件还能用研究模块（research mod-el）进行检测和编排处理。
5.研究模块 研究模块是用来追踪数据库中有关文件资料，以深入研究精子运动时间和方向的一组程序。单个细胞或成组细胞的运动可以作为时间的函数进行分析，该函数可提供的信息包括：加速度运动方向的改变及其改变速度，以及 VCL 与 ALH 特征等的详尽分析。Cellsoft的这一组附加程序对从事精子运动的研究人员来说是一种很有用的研究工具，但目前如果不使用一种昂贵的外部统计软件包，还缺乏轨迹分类处理功能，而 HT-M2030系统则已具备此功能。
6.超活跃模块 一种高度活跃但又非向前的运动类型（犹如舞蹈），称之为超活跃（hy-peractivation）现象，这种现象看来在常温哺乳动物的精子中普遍存在。在精子的鞭毛水平上，其确切的超活跃的运动类型因种属而异，某些种属还具有双相性质。例如：家兔精子的非前向性"舞蹈"样的运动类型是与其前向性"冲刺"样运动类型相互交错的。起初，并不认为人类精子具有真正的超活跃运动类型，但已发现在获能介质中人类精子的活动类型显示了某些超激活变化。现在则能够应用 Cellsoft系统基于精子运动特征来客观地分析人类精子的超活跃状态。这项工作成为一项商业专利的目标。直接作为附加 Cellsoft3000 系统的"超活跃模块"而被开发出来。
（三）HT-M2030
1.基本功能 基本的 HT-M2030是一个兼有 CASA 和 CASMA 功能的严密系统，包括一个具有温度控制功能的标本台，完整的光学和成像系统以及一台微机。多功能监视器，既可供用户进行系统设置和操作，又可用作成像系统、轨迹观察和编辑显示器以及结果显示器。该系统由 8个按钮控制，其中 3个控制标本台，另外 5个的功能由软件控制。另外还可外接键盘用于输入患者 /样品的信息。硬拷贝输出是由热导打印机提供的，但也可外接一台点阵打印机（或轨迹测绘器）。
在正常条件下，显然可以使用外接 VCR 甚至显微镜，但 HT-M2030系统可进行"实时"分析和结果输出。分析结果和数据也可以输送到系统的电脑中贮存以供随后复习和查询。
对于人类精子，相差光学显微镜即可提供最佳结果，但若应用深度为 200μm［最佳浓度（0.05～ 2.0）×106/mL］的玻璃毛细管或套管时，必须使用红外系统。对于浓度更高的精子悬液和全组分精液，HT-M2030能使用普通显微镜制备物以及 Makler、Horwell或 Petroff-Hauss-er计数板。使用这几种计数板时，最大可分析精子浓度取决于内部光学系统的放大倍数。
HT-M2030内部影像系统的一个优点是其图像频率为 30 Hz（FAST/SPLIT 系统）在世界各地均能通用。使用 220～ 240V，AC 电源 50Hz的交流电时，既可连接 NTSC 标准的录像机（模型 A：与当地买到的 LCR 或照相机不兼容）连用，也可与 PAL/SECAM 兼容的录像系统（模型 B）连用在 FAST/SPLIT 条件下可数码化的最大轨迹点为 20（2/3s）。这在某些情况下可能是一个缺点。
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